Том 17, № 4 (2022)

В 2023 году исполняется 120 лет со дня рождения профессора Николая Антоновича Шевченко, видного советского учёного, который внёс достойный вклад в разработку эволюционной и экспериментальной гистологии.

Проанализирована его деятельность в разные годы на кафедрах гистологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Первого Ленинградского медицинского института им. И.П. Павлова. Профессор Н.А. Шевченко провёл масштабное исследование эндотелия крупных кровеносных сосудов, обосновал концепцию о его гетероморфии, установил закономерности репаративной регенерации, изучил воспалительные разрастания эндотелия. Его исследования продолжили и развили положение выдающегося гистолога академика Н.Г. Хлопина об эндотелии как эпителии ангиодермального типа.

Приведены личные воспоминания авторов об Учителе.

Воспаление — неспецифический процесс, лежащий в основе патогенеза множества заболеваний, в частности COVID-19. Механизмы воспаления и сигнальные пути, участвующие в этом процессе, изучают с помощью различных моделей, в том числе in vitro на клеточных культурах. К наиболее доступной для воспроизведения можно отнести липополисахарид-индуцированную модель.

Проведён анализ научных работ, в которых использовали такую модель in vitro. Установлено, что воспаление, вызванное липополисахаридом, реализуется путём активации классических сигнальных путей (ядерного фактора «каппа-би», митоген-активируемой протеинкиназы и др.), изменения экспрессии циркулярных и некодирующих РНК и т.д. Оценку воспаления на рабочей модели в большинстве исследований осуществляли с помощью многих параметров, самым важным из которых была концентрация провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8, IL-1β, TNF-α). Липополисахарид-индуцированное воспаление моделировали на культурах разных клеток, наиболее адекватными оказались культуры моноцитов и макрофагов, что объясняется их переходом в М1-фенотип, а полноценно изучить механизмы патологического процесса в модели воспаления позволяло совместное культивирование разных клеток.

В обзоре обобщены передовые достижения в области создания органоидов — инструмента для точного моделирования злокачественных опухолей. Приведены условия воспроизведения микроокружения in vitro на основе органоидной технологии, рассмотрены различные методы культивирования тумороидов и проведён анализ их свойств на примере колоректального рака.

В заключительной части обзора суммированы литературные данные о применении тумороидов в прогнозировании терапевтического ответа опухоли на химиотерапевтические препараты; изучении механизмов, связанных с резистентностью; а также об оптимизации стратегий и потенциальных методов лечения пациентов со злокачественными опухолями. В настоящее время модель тумороидов широко используется в персонализированной медицине, фундаментальных исследованиях, скрининге противоопухолевых препаратов и для создания библиотек опухолей с различными мутационными профилями.

Аутосомно-рецессивный врождённый ихтиоз (АРВИ) — гетерогенная группа заболеваний, вызванных мутациями по крайней мере в десяти генах. АРВИ характеризуется разной степенью гиперкератоза и наличием десквамирующихся с рождения пластинок эпидермиса на поверхности кожи. Несмотря на разнообразие мутаций и фенотипических проявлений АРВИ, от 32 до 68% случаев заболевания обусловлены мутацией в гене трансглутаминазы-1.

В настоящее время терапия АРВИ направлена на снижение симптомов заболевания. Для облегчения клинических симптомов применяют увлажняющие средства, кератолитики, ретиноиды и другие косметические средства, улучшающие состояние кожи пациентов. Для исправления эктропиона век при АРВИ обычно используют трансплантацию кожного лоскута.

Существует высокая необходимость развития терапии, направленной на первопричину АРВИ. Генная и клеточная терапия развиваются как перспективные методы лечения АРВИ, с помощью которых можно корректировать функциональную активность мутантных генов, в частности трансглутаминазы-1. В обзоре обсуждаются современные исследования подходов генной и клеточной терапии и их дальнейшие перспективы в лечении пациентов при различных формах ихтиоза.

Обоснование. Сфероиды представляют собой самоорганизованные кластеры-колонии клеток с тканеподобной архитектоникой. Процесс формирования сфероидов и последующие манипуляции с ними, позволяющие сохранять трёхмерную структуру таких клеточных моделей, методологически сложны для воспроизводства. Это связано с составом и объёмом питательной среды, продолжительностью культивирования и, что наиболее важно, клеточными взаимодействиями с субстратом для культивирования. В настоящее время для оптимизации условий культивирования клеток в 3D-модели применяют различные матриксы и каркасы: от простых гидрогелей до сложных природных и синтетических композитов.

Цель исследования — сравнительный анализ формирования гомогенных (3D) и гетерогенных (3D-2) сфероидов из опухолевых и (или) стромальных клеток рака молочной железы с применением простых гидрогелей, таких как агароза, желатин и Matrigel™, а также при использовании культурального пластика с низкими адгезивными свойствами.

Материалы и методы. В качестве моделей были выбраны линии опухолевых клеток рака молочной железы MCF7, MDA-MB-231 и SK-BR-3 и линии стромальных фибробластов BrC4f, BrC120f и BN120f. Сфероиды получали на подложке из простых гидрогелей или при культивировании на низкоадгезивном пластике. Процессы формирования и роста сфероидов, а также «раздавленные препараты» визуализировали с помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа Nikon серии Eclipse Ti-S (Nikon, Япония).

Результаты. Показано, что гидрогель на основе желатина не подходит в качестве субстрата для получения 3D- и 3D-2-структур рака молочной железы ни для одной из исследуемых в работе культур клеток. Один тип подложки не позволяет получить весь спектр опухолевых, стромальных и гетерогенных 3D-структур: для сфероидов из фибробластов больше подходит подложка из агарозы, а для опухолевых клеток — Matrigel™; применение низкоадгезивных планшетов Nunclon™ Sphera™ предпочтительно для культивирования 3D-2-сфероидов. Оптимизация методологии работ со сфероидами показала, что применение охлаждённого пластика и растворов является технологическим преимуществом при работе со сфероидами, растущими в отсутствие гидрогелей.

Заключение. Предложенные подходы для формирования и гомогенных (3D), и гетерогенных (3D-2) сфероидов из опухолевых и (или) стромальных клеток рака молочной железы представляют собой обобщённое руководство по наиболее эффективному способу получения сфероидов различного клеточного состава.

Обоснование. Важным аспектом методологических подходов к изучению внутриклеточного метаболизма является оценка метаболического профиля клеток. Один из показателей, которые можно использовать для получения такого профиля, — интенсивность поглощения кислорода при разложении и трансформации субстратов клетками.

Цель исследования — разработка метода оценки физиолого-биохимических характеристик клеток, основанного на регистрации их респираторной активности и формировании метаболического профиля, а также анализ применения этого метода для оценки угнетения и восстановления клеток паренхимы печени в результате воздействия различных веществ.

Материалы и методы. Разработанный метод включал применение кислородного электрода Кларка с исследуемыми клетками, локализованными в области его рабочей зоны, для измерения концентрации растворённого кислорода в непосредственном окружении живых интактных клеток, что обеспечивает оценку их метаболического профиля и физиологического состояния. Эксперименты выполняли на фрагментах среза паренхимы печени крыс линии Wistar. Было поставлено 3 серии экспериментов: в первой (серии А) получали метаболический профиль паренхимы печени; во второй (серии Б) определяли стабильность сигнала паренхимы на цитрат натрия в зависимости от времени; в третьей (серии В) регистрировали и оценивали воздействие гепатотоксических соединений на ткань печени в режиме реального времени. В качестве субстратов для определения оптимального метаболического профиля ткани печени использовали растворы глюкозы, фруктозы, сахарозы, цитрата натрия, пирувата натрия, L-глутамина, этанола и гидрохинона, в качестве токсических агентов — растворы метанола и кларитромицина.

Результаты. Продемонстрированы формирование метаболического профиля ткани на примере паренхимы печени и возможность отслеживания изменений состояния клеток при токсическом воздействии в режиме реального времени.

Заключение. Разработанный метод оценки физиолого-биохимических характеристик клеток может использоваться для отслеживания метаболической активности, угнетения и восстановления клеток паренхимы печени при воздействии субстратов и токсических соединений.

Обоснование. В настоящее время для эффективной регенерации костной ткани разрабатываются биосовместимые матриксы, содержащие плазмидные конструкции с генами остеоиндукторов.

Цель — in vitro исследование свойств ген-активированных матриксов на основе коллагена и обогащённой тромбоцитами плазмы, импрегнированных полиплексами с геном костного морфогенетического белка 2.

Методы. В исследовании использованы методы флуоресцентной микроскопии, проточной цитофлуориметрии, иммуноферментного анализа, ПЦР в режиме реального времени и МТТ-тест.

Результаты. С помощью МТТ-теста и флуоресцентной микроскопии по выявлению живых и мёртвых клеток показано, что полученные матриксы обладают высокой цитосовместимостью. Включение плазмидных конструкций в гидрогелевые матриксы на основе коллагена и фибрина обеспечивает их пролонгированное высвобождение в течение 25 сут. Методами проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии установлено, что полиплексы, высвободившиеся из матриксов, способны эффективно трансфицировать мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани крыс. Через 3 нед инкубации клеток с матриксами, импрегнированными полиплексами с геном BMP2, методом иммуноферментного анализа выявлено 25-кратное увеличение продукции белка BMP-2. Секретируемый трансфицированными клетками белок BMP-2 индуцирует остеогенную дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, что подтверждается повышением экспрессии гена остеопонтина и минерализацией внеклеточного матрикса.

Заключение. Разработанные матриксы в перспективе могут быть использованы в генной терапии при повреждениях костной ткани.