Features of obtaining and prospects for the use of colorectal tumor organoids

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Колоректальный рак (КРР) занимает одну из верхних строчек в структуре заболеваемости и смертности среди всех видов онкологических процессов. Он является вторым по распространённости видом рака у лиц женского пола и третьим — у лиц мужского пола. В процентном отношении заболеваемость КРР среди всех видов рака составляет 7,9%, при этом 90% заболевших — люди старше 50 лет [1]. Анализ статистики за период с 2011 по 2021 год показывает рост заболеваемости КРР на 70,6%, пик приходится на 2020 год, когда было выявлено 282,6 тыс. случаев, в 2021 году — 282,1 тыс.

Колоректальный рак — это совокупность злокачественных новообразований различных отделов толстой кишки: прямой, сигмовидной, ободочной (табл. 1 [2]).

 

Таблица 1. Динамика заболеваемости колоректальным раком в России в 2011–2021 годах, тысяч человек

Локализация, нозологическая форма	Годы
	2011	2012	2013	2014	2015	2016	2017	2018	2019	2020	2021*
Ободочная кишка	111,9	116,7	121,4	127,5	132,9	138,1	142,8	149,6	157,8	161,6	161,0
Прямая кишка, ректосигмоидное соединение	87,3	90,4	93,4	98,0	101,6	105,4	108,3	111,6	118,1	121,0	121,1
Всего	199,2	207,1	214,8	217,5	234,5	243,5	251,1	261,2	275,9	282,6	282,1

* рассчитано по населению Российской Федерации на 2020 год.

 

КОЛОРЕКТАЛЬНЫЙ РАК: ПРОГНОЗ ВЫЖИВАЕМОСТИ, ОСНОВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Наследственные и спорадические формы колоректального рака

Колоректальный рак имеет наследственные и спорадические формы. Бόльшая часть случаев относится к спорадическим, на развитие которых влияют внешние канцерогенные факторы [3]. Только 5–10% всех зарегистрированных случаев КРР связаны с наличием у больных наследственных онкологических синдромов. Основные из них — наследственный неполипозный КРР (синдром Линча) и семейный аденоматоз толстой кишки [4, 5].

Синдром Линча — аутосомно-доминантное заболевание, вызванное мутациями в генах репарации неспаренных нуклеотидов (DNA mismatch repair, MMR), в частности MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 [6]. Подобные нарушения в репарационной системе MMR провоцируют появление опухолей, характеризующихся микросателлитной нестабильностью [4]. Микросателлиты — это короткие повторяющиеся последовательности ДНК, которые встречаются во всём геноме. Именно повторяющиеся фрагменты позволяют ДНК-полимеразе проскальзывать в этих участках, из-за чего происходят мутации и несоответствия оснований [5].

Семейный аденоматоз толстой кишки также является аутосомно-доминантным заболеванием. Примерно у 80% больных мутации идентифицированы в гене APC. У лиц с этой патологией, как правило, развивается более 100 аденом толстой кишки (у 50% пациентов — в возрасте 15 лет, у 95% — в возрасте 35 лет); при отсутствии терапии к 40 годам КРР возникает почти у всех пациентов с семейным аденоматозом толстой кишки [7].

Молекулярные механизмы возникновения спорадического колоректального рака

Существует три основных пути развития КРР: хромосомная нестабильность, опухоли с фенотипом CIMP (CpG island methylation phenotype) и микросателлитная нестабильность (MSI) [8].

Опухоли с хромосомной нестабильностью характеризуются количественными и структурными хромосомными аберрациями, мутациями в различных протоонкогенах и генах-супрессорах опухолей (APC, TP53, протоонкоген Kirsten-ras (KRAS)), а также в гене DCC [9]. CIMP КРР характеризуется широко распространённым метилированием островков CpG в промоторных областях, что приводит к инактивации генов MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 [10]. На долю MSI приходится 15% спорадических случаев КРР. В настоящее время всем пациентам с КРР рекомендуется проводить скрининг на мутации в системе MMR [11]. Примерно у половины пациентов с КРР выявляют мутации во втором экзоне гена KRAS, относящегося к семейству протоонкогенов RAS [1].

Прогноз выживаемости при колоректальном раке

Основываясь на системе TNM, КРР подразделяют на 4 стадии с разными прогностическими и терапевтическими последствиями [12].

Для КРР характерна внутриопухолевая гетерогенность [13], которую связывают с метастазированием, высоким риском рецидива и резистентностью ко многим известным препаратам, что напрямую указывает на неблагоприятный прогноз течения заболевания.

Для более эффективного лечения КРР необходимы персонализированные in vitro исследования индивидуальной гетерогенности и восприимчивости опухоли к лекарственным препаратам у отдельных пациентов. Достижения в области стволовых клеток привели к созданию перспективной технологии органоидов, которые повторяют трёхмерную структуру тканей in vitro и более точно отражают молекулярные, биохимические и геномные характеристики опухоли, профили экспрессии генов по сравнению с линиями клеток [14], а также воспроизводят опухолевое микроокружение. Подобные модели органоидов, известные как тумороиды, получили широкое распространение при изучении злокачественных новообразований, определении потенциальных терапевтических мишеней и оценке эффективности известных и новых (разрабатываемых) препаратов для дальнейшей терапии.

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СТРУКТУРА 3D-КУЛЬТУР ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, ДОСТОИНСТВА И НЕДОСТАТКИ МЕТОДОВ

Органоиды представляют собой микроскопические самоорганизующиеся трёхмерные структуры, выращенные из стволовых клеток in vitro. Они повторяют многие морфологические и функциональные характеристики органов in vivo, из которых были получены. Впервые метод получения органоидов был описан в 1944 году J.A. Holtfreter при изучении эмбрионов амфибий [15]. Более 30 лет назад Mina Bessel культивировала сфероиды клеток эпителия молочной железы человека [16]. Метод довольно быстро нашёл применение в медицине и биологии: его стали использовать для моделирования развития злокачественных опухолей in vitro, а также для изучения воздействия лекарственных препаратов.

Монослойные культуры опухолевых клеток in vitro — недорогие и относительно простые в использовании, однако они не отражают точных характеристик опухолей, сложные взаимодействия между клетками которых и между ними и микроокружением имеют решающее значение в канцерогенезе. На смену пересеваемым линиям клеток пришли 3D-модели — тумороиды (опухолевые органоиды).

Сфероиды на средах с низким уровнем адгезии и метод висячих капель

Сфероиды представляют собой скопления опухолевых клеток, выращенные на субстрате с низким уровнем адгезии. Образование такой структуры позволяет раковым клеткам находиться в непосредственной близости друг от друга в трёхмерной конфигурации [17].

Формирование сфероидов также происходит при использовании метода висячей капли: в нём используется сила натяжения поверхности питательной среды для агрегации клеток в сфероид [18]. У обоих методов одинаковые ограничения в использовании — это низкий уровень прикрепления органоидов к субстрату. Основными преимуществами сфероидов и метода висячих капель являются их низкая стоимость, лёгкость воспроизведения модели и простота использования [19].

Получение 3D-культур опухолевых клеток с использованием матригеля (Matrigel®)

Для выращивания 3D-культур опухолевых клеток и имитации окружающего их внеклеточного матрикса (ВКМ) используют специальные биологические трёхмерные среды, способные выполнять каркасную функцию. К ним относится матригель (Matrigel®), децеллюляризированные матрицы и коллаген [20]. Подобное сходство свойств окружающей органоиды среды необходимо для лучшей биомимикрии формирующихся агрегатов. Существуют различные способы для создания искусственного ВКМ: 3D-биопечать гидрогелей [21], гиалуроновая биопечать с регулировкой жёсткости молекулярной решётки [22], децеллюляризация ткани, применение пептидных гидрогелей [23].

Матригель чаще, чем другие 3D-матриксы, используют в качестве субстрата для культивирования клеток. По составу он очень близок к базальной мембране, которая богата ламинином, коллагеном, факторами роста [24]. Матригель — это солюбилизированный матрикс базальной мембраны, секретируемый клетками саркомы мышей Энгельберт–Холм–Сворм [25]. Данная линия клеток была обнаружена у мышей дикого типа, изначально идентифицирована как хондросаркома из-за наличия обильного ВКМ. Экстракт в основном состоит из ламинина-111 и других белков в высокой концентрации (более 4 мг/мл), он превращается в гель при 24–37 °C [26]. К недостаткам матригеля можно отнести небольшие колебания состава белков и их концентрации между разными партиями. Ещё одним его недостатком является низкая проницаемость для веществ ростовой среды и относительно высокая плотность, что может привести к сложностям при изучении механизмов инвазии и метастазирования опухолевых клеток [26]. Ряд дополнительных исследований in vitro показал потенциальную роль базальной мембраны в стимуляции клеточной адгезии, дифференцировке клеток и росте тканевых эксплантатов. Например, при выращивании на матригеле с экстрактом базальной мембраны (ЭБМ/матригель) эпителиальные клетки молочной железы прекращали пролиферацию, образовывали ацинарные структуры и увеличивали продукцию белков молока [27]. Костные клетки в этих условиях формировали кластеры, пронизанные сетью канальцев с отростками остеоцитов внутри. Опухолевые же клетки, выращенные в 3D-культуре на ЭБМ/матригеле, продолжали пролиферировать и демонстрировали инвазивный потенциал. Был разработан количественный и простой анализ in vitro, позволяющий измерить инвазивную активность. Интересно, что некоторые «спящие» злокачественные клетки оставались в покое и в таком матриксе, однако они хорошо размножались на поверхности планшетов, предназначенных для выращивания клеточных культур. Биоматериал (клетки и ткани, включая стволовые клетки), выращенный или покрытый ЭБМ/матригелем, широко используется для трансплантации; при таких условиях наблюдается более высокая выживаемость и регенерация тканей после трансплантации [28].

Каркасы для биопечати и клеточные чернила

Трёхмерная (3D) биопечать — современная технология послойного нанесения так называемых биочернил для изготовления тканеподобных конструкций (в том числе функциональных живых тканей или органов) со структурой, напоминающей их природные прототипы. Трёхмерную биопечать можно разделить на экструзионную, капельную и лазерную. Биопечать на основе экструзии использует механические, пневматические или соленоидные системы дозирования для нанесения биочернил в виде непрерывных нитей. Капельная биопечать основана на использовании биочернил в виде небольших жидких частиц при помощи электрического воздействия. Лазерная биопечать печатает 3D-структуры по принципу фотополимеризации материала, её можно применять для точного позиционирования клеток, например при лазерном направленном письме (laser direct-write) и лазерно-индуцированном прямом переносе [29].

Выбор биочернил для каждого способа биопечати обычно зависит от физических и химических свойств используемых материалов, а также их биосовместимости [30]. Разработанные биочернила на основе альгинатов и поливинилового спирта позволяют печатать каркасы с заданной пористостью, жёсткостью, концентрацией и другими параметрами [31]. К недостаткам метода биопечати относят негативное влияние биочернил на жизнеспособность некоторых культур, что приводит к усложнению экспериментов. В литературе описаны варианты каркасов на основе хитозана и желатина для культивирования тумороидов рака лёгких [32].

Основной прорыв в сфере биопечати — печать тканей и органов для дальнейшей трансплантации пациентам. В частности, производится печать таких органов и структур, как кровеносные сосуды, кости и суставы [33]. Печать сосудов (капилляры, венулы, артериолы) сложна из-за их маленького диаметра, однако при помощи испаряемых биочернил на основе Pluronic F-127 удалось получить каналы диаметром до 45 мкм [34]. Описаны эксперименты, в которых были напечатаны пористые каркасы из полипропилена фумарата, подходящие для применения в инженерии костной ткани [35]. Из PEG и PCL были напечатаны каркасы в форме ушной раковины, заселённые хондроцитами с целью дальнейшей трансплантации [36]. Разработаны также новые наноцеллюлозно-альгинатные биочернила, позволяющие поддерживать культуру хондроцитов, полученных из хрящевой части носовой перегородки человека в напечатанных тканях [33].

При помощи 3D-биопечати также были сформированы органоиды с ВКМ молочной железы [21]. G. Urkasemsin и соавт. [37] сообщают о получении из стволовых клеток этим методом эпителиальных органоидов, подобных слюнным железам. Такие органоиды обладают нейронной сетью, которая реагирует на нейростимуляторы слюноотделения.

Помимо печати органов и органоидов, биопечать также используется для получения разных тканей в качестве моделей in vitro для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и ряда других целей [38].

Проточные методы и чипы

Проточные системы и системы биореакторов используют для получения органоидов, поскольку они позволяют совместно культивировать разные виды клеток. С их помощью можно формировать микроопухоли со стромой и компартментализовать клетки в соответствии с заданными параметрами. В 2020 году проведено исследование отдельных тумороидов КРР, показавшее возможность применения различных методов анализа на таких моделях (в частности, биоинформатического) [39]. Основное преимущество проточного метода — возможность получения органоидов или тумороидов в больших количествах, что позволяет проводить множественные персонализированные исследования.

В качестве модели применяют также микрофлюидные органоиды, выращенные на чипах. К таким платформам относится OrganoPlate, которая позволяет одновременно работать с 40 микрофлюидными чипами с клеточными культурами. С её помощью, например, получали почечные тубулоиды для высокоперсонализированного моделирования заболеваний выделительной системы [40]. К достоинствам этой модели можно отнести регулируемый газовый состав (включая кислород) и состав питательных веществ, необходимых для культур. В таких моделях отсутствуют компоненты ВКМ, однако их можно вводить дополнительно [41]. На моделях с применением чипов существует возможность измерять глубину инвазии опухолевых клеток.

Сравнение достоинств и недостатков разных методов получения 3D-культур опухолевых клеток представлено в табл. 2 [22, 23, 25, 42–47].

 

Таблица 2. Сравнение методов получения 3D-культур опухолевых клеток

Метод	Характеристики	Источник
Среды с низким уровнем адгезии Метод висячей капли	Достоинства: низкая стоимость; высокая производительность; воспроизводимость; простота использования Недостатки: строение 3D-культур опухолевых клеток отличается от опухолей in vivo из-за отсутствия стромы; нет внеклеточного матрикса и коллагена, к которому сфероиды могут прикрепляться; невозможно измерить опухолевую инвазию в окружающие ткани	[22, 42, 43]
Матригель (Matrigel®)	Достоинства: можно культивировать совместно со стромальными клетками; можно измерять расстояние инвазии; при культивировании белки внеклеточного матрикса положительно влияют на рост органоидов; хорошая проницаемость для питательных веществ Недостатки: высокая стоимость; вариабельность состава матригеля в зависимости от партии (в частности, факторов роста TGF-β, EGF и VEGF, а также от общей концентрации белков); трудно добиться нужной степени компартментализации клеток	[25, 43, 44]
Каркасы для биопечати и клеточные чернила	Достоинства: возможность регулировать физические (пористость, жёсткость) и химические (концентрация, состав) свойства каркаса (3D-матрикса); возможность исследовать поведение опухоли в изменяющихся условиях Недостатки: высокая стоимость; из-за искусственного происхождения используемых биочернил жизнеспособность и коэффициент прикрепления клеток могут быть низкими	[25, 45, 46]
Проточные методы и чипы	Достоинства: возможность выращивать одновременно несколько культур и воссоздавать давление тканевой жидкости; достижимость нужной компартментализации, возможность определить границы между опухолью и стромой; возможность измерения расстояния инвазии между опухолевыми и стромальными клетками; высокая производительность Недостатки: высокая стоимость; отсутствие внеклеточного матрикса, однако его можно вводить в систему дополнительно	[23, 43, 47]

 

ТУМОРОИДЫ (ОПУХОЛЕВЫЕ ОРГАНОИДЫ)

Тумороиды представляют собой трехмёрные самоорганизующиеся и самообновляемые агрегаты опухолевых клеток с плотным ВКМ, активно использующиеся в тканевой инженерии и моделировании опухолевых новообразований in vitro [32]. Хотя такие модели могут быть дорогостоящими в зависимости от типа выращиваемой in vitro опухоли, они характеризуются высоким сходством с первичной опухолью, из которой получены. В целом модель тумороидов позволяет воспроизвести in vitro геномные, молекулярные и биохимические характеристики опухоли, профили экспрессии её генов, а также имитировать опухолевое микроокружение.

Основные преимущества использования тумороидов по сравнению с линиями опухолевых клеток — их большее сходство с первичной опухолью благодаря наличию пролиферативного градиента, передаче сигналов между ВКМ и клетками, неравномерной доступности питательных веществ для клеток органоида, возможности паракринной передачи сигнала; увеличение контактов между соседними клетками за счёт их выращивания в 3D-условиях. В работе [44] проведена сравнительная оценка токсичности многочисленных противоопухолевых препаратов в отношении различных типов опухолевых клеток, выращенных в системах 3D-культивирования и в формате 2D-монослоя. Исследования показали, что опухолевые клетки, полученные в 3D-системе, менее чувствительны к противоопухолевым агентам, чем при 2D-условиях культивирования.

На органоидах, полученных из биоптата КРР и соседней здоровой ткани, исследована экспрессия мРНК. Показано, что органоиды являются адекватной моделью для анализа транскриптома, поскольку в опухолевых органоидах КРР установлена повышенная транскрипция опухолевых маркёров (PROX1, BAMBI и PTCH1), а в нормальных органоидах повышенно экспрессировались гены дифференцированных клеток: например, СА2 — маркёр клеток цилиндрического эпителия или MUC1 — маркёр бокаловидных клеток [45].

При сравнении моделей линий клеток и тумороидов выделяют следующие преимущества последних: высокое сходство с первичной опухолью, высокая вероятность получения стабильной (пересеваемой) культуры, возможность персонализированного подхода и воспроизводимость ответов на препараты у пациентов (табл. 3). Преимущества адгезивных линий клеток — низкая стоимость, простота культивирования и быстрое получение результатов высокопроизводительного скрининга [46]. Ключевыми свойствами тумороидов являются повторение и сохранение гетерогенного клеточного состава первичных опухолей, мутационного профиля первичных опухолей и паттернов экспрессии общих маркёров клинической диагностики [48]. В многочисленных исследованиях показано, что из первичных опухолей КРР получаются различные культуры тумороидов [42, 43, 47]. Каждая культура уникальна, их гетерогенный клеточный состав (гистологический анализ), профиль экспрессии генов (анализ транскриптома), мутационный профиль (анализ совокупности соматических мутаций) отражают уникальные свойства исходной опухоли. M. Van De Wetering и соавт. [45] сравнили профили соматических мутаций, обнаруженные в тумороидах и биоптатах, из которых они были получены (первичная опухоль). Частота медианного совпадения составляла 0,88, что является довольно высоким показателем.

 

Таблица 3. Сравнение моделей линий клеток и тумороидов

Характеристики	Линии клеток	Тумороиды
Вероятность (возможность) получения	Низкая	Высокая
Сходство с первичной опухолью — мутационный профиль	Низкое	Высокое
Сходство с первичной опухолью — гетерогенный клеточный состав	Низкое	Высокое
Персонализированный подход	–	+
Стоимость	Низкая	Средняя
Высокопроизводительный скрининг	+	+
Воспроизводимость ответов на препараты у пациентов	–	+
Время получения результатов скрининга	<1 мес	1–3 мес

 

Строение тумороидов

В результате изучения строения тумороидов, полученных из клеток карциномы лёгкого китайского хомячка в 1971 году, их структуру разделили на 3 зоны: 1) наружная зона, состоящая из быстро делящихся клеток; 2) промежуточная зона медленного деления; 3) зона некроза в центре, схожая с макроструктурой карцином человека и животных [49].

Рост тумороидов на неадгезивной поверхности делится на три этапа: агрегация, компактизация, нарастание. Е-кадгерин, актин, микротрубочки и тирозинкиназа-2 — активные элементы, обеспечивающие адгезию на каждом этапе. Однако роль тирозинкиназы-2 с каждым этапом становится всё больше, а е-кадгерина и актина — меньше. При сравнении развития тумороидов и солидных опухолей in vivo было показано, что первые две фазы приходятся на метастазирование, на адгезию опухоли и её стабилизацию, а последняя фаза — на пролиферацию [50]. Тумороиды КРР, полученные от пациентов, повторяют характеристики опухоли, из которой они получены, и являются мощным инструментом для исследования рака [45, 51, 52]. Применение таких моделей имеет практическое значение для прогнозирования результатов лечения пациентов в условиях персонализированной медицины в области онкологии [53].

Получение тумороидов колоректального рака

Для получения тумороидов in vitro используется следующий алгоритм: ткань хирургически резецируется у ранее не леченных пациентов с диагнозом КРР, поскольку противоопухолевая терапия может исказить результат и полученная культура тумороидов будет отличаться от первичной опухоли [54]. Первичную опухолевую ткань промывают фосфатно-солевым буфером (PBS) с антибиотиком-антимикотиком (гентамицином, метронидазолом). Затем образцы разрезают на фрагменты размером 1×1 мм и помещают в среду с протеазами (коллагеназа XI, диспаза II, TrypLE) на 40–60 мин при 37 °C для разделения на одиночные клетки. После обработки ферментами полученную суспензию пропускают через фильтр с ячейками 70 мкм для удаления крупных кусочков ткани и центрифугируют для осаждения изолированных опухолевых клеток. Полученные опухолевые клетки заключают в матригель и осуществляют культивирование в среде с факторами роста, низкомолекулярными ингибиторами протеинкиназ, антиоксидантами и др. [55].

Важные параметры, на которые необходимо обратить внимание при работе с тумороидами in vitro, — это соотношение концентрации O₂/CO₂, градиент образующихся катаболитов/метаболитов, скорость инвазии тумороидов, наличие или отсутствие некротической оболочки тумороидов [56].

ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ ТУМОРОИДОВ

Тумороиды являются удобной моделью для фундаментальных исследований в онкологии, с их помощью можно проводить поиск мутаций для персонализированной терапии, измерять уровни экспрессии генов в опухоли, проводить ДНК-секвенирование с дальнейшим анализом мутационного профиля. Основные направления применения тумороидов представлены на рис. 1.

 

Рис. 1. Основные направления применения тумороидов в научных исследованиях.

 

Фундаментальные исследования на тумороидах

В работе [57] показано, что тумороиды КРР, в которых были внесены мутации в генах APC, SMAD4, TP53 и KRAS, росли аналогично опухолям in vivo и развивали опухоли при трансплантации в капсулу почки у мышей. У мышей, нокаутированных по этим генам, наблюдалось различие в развитии КРР: так, для опухолей с мутациями в трёх генах (APC, SMAD4 и TP53) фиксировались отсутствие инвазивного роста и низкая пролиферативная способность, в то время как у опухолей с мутациями в четырёх генах (включая KRAS) одновременно наблюдалось увеличение скорости инвазии.

Инактивация APC и TP53 также вызывает анеуплоидию, провоцирующую опухолевую прогрессию. M. Matano c соавт. [58] методом CRISPR/Cas9 внесли мутации в 5 генов, которые чаще всего отвечают за злокачественную трансформацию (APC, SMAD4, TP53, KRAS, PIK3CA). Полученные на тумороидах результаты свидетельствуют о том, что данные мутации позволяют поддерживать токсическое микроокружение опухоли, но для инвазивного поведения требуются дополнительные молекулярные повреждения [58]. Существует исследование, демонстрирующее, что выбор между мезенхимально-эпителиальным переходом или эпителиально-мезенхимальным переходом при ответе на гипоксию опосредуется регуляторной сетью, включающей HIF1α, p53, miR-34a, INH3, PP1 и STAT3 [59]. К эпителиально-мезенхимальному переходу и дальнейшему метастазированию также приводит сверхэкспрессия клаудина-1, однако клаудин-7, напротив, является онкосупрессором. На модели тумороидов изучена взаимосвязь между уровнем образования клаудина-1 и клаудина-7 и метастазированием опухоли, которая подтвердилась при оценке выживаемости пациентов и их опухолевой резистентности к химиотерапии. Транскриптомный анализ когорты пациентов с КРР выявил следующие гены, продукты которых связаны с клаудином: PIK3CA, SLC6A6, TMEM43 и ASAP1 [60]. Активность гена IDO1 в эпителии непосредственно способствует онкогенезу толстого кишечника путём активации пролиферативного/антиапоптотического пути PI3K/Akt [61]. На модели тумороидов показано, что более четверти колоректальных опухолей с недостаточностью работы системы MMR, пролеченных неоадъювантной химиотерапией, показали прогрессирование заболевания, но были чувствительны к химиолучевой терапии, поэтому статус MMR необходимо определять заранее при всех видах КРР с тщательным мониторингом ответа на неоадъювантную химиотерапию [10]. На органоидах, полученных из первичной опухоли и метастазов, показано, что метастазирование сопровождается повышением уровня мутаций по сравнению с исходной опухолью и «потерей зависимости» от нишевых факторов [52]. При колоректальном канцерогенезе перикриптальные клетки пролиферируют с образованием опухоль-ассоциированных фибробластов, которые формируют особенное иммунное микроокружение, способствующее развитию опухоли. Предотвращение экспансии/дифференцировки этих клеток может быть эффективным терапевтическим подходом при КРР [62]. Идентифицированы также синергические комбинации лекарств для воздействия на KRAS-зависимые химиолучерезистентные виды рака на модели КРР [63]. M. Van De Wetering с соавт. [45] выполнили скрининг 83 препаратов на созданной библиотеке органоидов КРР и показали, что мутация TP53 обусловливает устойчивость к препарату nutlin-3a — ингибитору MDM2, мутации RAS обусловливают устойчивость к цетуксимабу — ингибитору EGFR. Установлено, что при мутации RNF43 резко увеличивается чувствительность к ингибиторам выброса (секреции) Wnt.

C.S. Verissimo с соавт. [64] показали, что мутация G12D в гене KRAS вызывает устойчивость к комбинации общих ингибиторов HER и ингибиторов MEK, в отличие от опухолей KRAS дикого типа, которые погибают при действии этих препаратов. Полученные на тумороидах основные результаты изучения генов и механизмов, влияющих на развитие КРР, перечислены в табл. 4 [51, 65–73].

 

Таблица 4. Результаты исследования мутаций, полученные на тумороидах колоректального рака

Биомаркёр	Частота встречаемости, %	Локализация мутаций	Участник пути	Ожидаемый результат терапии	Лечение	Источник
APC	8	Экзоны 1 и 15	Wnt/β-катенин	Резистентность к HDAC и 5-фторурацилу	Эрлотиниб + NSAIDs	[65–67]
SMAD4	10–15	Экзоны 3, 4, 5, 11, 12	Сигнальный путь TGF-β	Резистентность к 5-фторурацилу и неоадъювантной химиотерапии	n/a	[68, 69]
TP53	60	Экзоны 5, 7, 8		n/a	Nutlin-3* + TRAIL	[51, 70, 71]
KRAS	40	Экзоны 2, 3, 4	Усиление пролиферации за счёт активации сигнального пути EGFR	Устойчивость к анти-EGFR терапии	Химиотерапия + бевацизумаб	[69]
NRAS	3–5					[69]
BRAF	8–12	Экзон 15			FOLFOXIRI + бевацизумаб	[1, 72]
PIK3CA	34	Экзоны 9 и 20	Сигнальный каскад PIK3CA/AKT/mTOR	n/a	n/a	[1, 73]
ERBB (HER2)	5	Амплификация хромосомы 17	Тирозиновая протеинкиназа семейства EGFR/ERBB	Чувствительность к анти-HER2-терапии	Трастузумаб* +/– пертузумаб* или +/– лапатиниб*	[69]
Гены MSI/MMR	12–15	n/a	Система репарации неспаренных нуклеотидов	Чувствительность к ингибиторам контрольных точек	Пембролизумаб* + ниволумаб* +/– ипилимумаб*	[69]

Примечание: n/a (not available) — лечение и влияние терапии в литературе не описаны. * препарат не зарегистрирован в Государственном реестре лекарственных средств Российской Федерации http://grls.rosminzdrav.ru/GRLS.aspx.

 

Разработка новых противоопухолевых препаратов

Разработку противоопухолевых препаратов затрудняет отсутствие репрезентативных модельных систем, которые могли бы адекватно воспроизводить основные характеристики опухоли in vivo [71].

На модели тумороидов показано, что соединение FL3 ингибирует Wnt-зависимый путь, что приводит к замедлению и остановке опухолеобразования in vitro [72]. Экстракт растения Andrographis paniculata также оказался высокоэффективным для лечения хеморезистентности КРР, так как он оказывает антипролиферативный эффект на клетки с устойчивостью к 5-фторурацилу [73]. Используют комбинации методов в зависимости от целей исследования: в частности, CRISPR/Cas9 редактирование тумороидов, полученных из клеток пациента, позволяет определять новые терапевтические мишени и разрабатывать таргетные препараты. Именно таким методом был выявлен механизм работы гена-супрессора опухоли ARID1A [74]. В некоторых работах на тумороидах исследовали длину теломер и активность теломераз с целью дальнейшего использования их в качестве мишени для терапии [75]. Однако, даже если известна молекулярная мишень, на которую действует конкретное лекарственное средство, это не гарантирует, что пациенты будут восприимчивы к разработанному лечению [76].

Персонализированная медицина

Отсутствие релевантных моделей опухолей, подходящих для скрининга лекарств, показало необходимость в системах, которые лучше поддаются моделированию заболевания для подбора индивидуальной схемы лечения. Модель тумороидов позволяет персонализированно подбирать наиболее эффективную противоопухолевую терапию пациентам, в том числе на ранних стадиях заболевания [71]. Для этого от больного необходимо получить культуру тумороидов, которые выращивают в многолуночных планшетах (96 или 364), затем обрабатывают противоопухолевыми агентами и анализируют выживаемость, в результате назначают препарат, к которому опухоль наиболее восприимчива.

Опухоли КРР характеризуются сильной клеточной гетерогенностью, что может отражаться в различных ответах на лекарственные препараты в культуре тумороидов, полученной от одного пациента [45]. M. Van De Wetering и соавт. [45] выполнили полногеномное секвенирование культур тумороидов в имеющемся у них биобанке для исследования гетерогенности КРР, в результате чего были обнаружены изменения в опухолевых супрессорах APC, FBXW7, TP53 и SMAD4 и мутации в генах KRAS и PIK3CA.

Группой F. Weeber с соавт. [71] на когорте пациентов проведено исследование, в результате которого установлено, что результаты тестирования эффективности препаратов на органоидах соотносятся с клиническими результатами терапии.

Большой скрининг для персонализированной медицины КРР проводили C. Pauli с соавт. [51]. Из 60 культур тумороидов создали биобанк, провели полноэкзомное секвенирование и проверили ответ культур тумороидов на 160 препаратов. Разработка методов секвенирования следующего поколения (next generation sequencing, NGS) позволила провести эффективное секвенирование ДНК опухолей. NGS помогло сделать значительный шаг вперед в персонализированной медицине, позволив обнаруживать соматические драйверные мутации, мутации зародышевой линии, а также мутации, приводящие к резистентности. Имеются исследования, позволяющие выявлять онкомаркёры рака груди и прогнозировать дальнейшую терапию [77]. Модель тумороидов в персонализированной медицине даёт возможность «нацеливаться» на определённые опухолевые клетки, оставляя здоровые клетки неповреждёнными [78]. В исследовании J. Drost и H. Clevers [78] использовали тумороиды гепатоцитов для исследования гепатотоксичности, поскольку именно она часто является причиной отказа от терапии рака печени. Авторами было сделано предположение, что препарат, который покажет свою эффективность в терапии, должен вызывать апоптоз только опухолевых органоидов и не проявлять токсичности в отношении нормальных гепатоцитов.

На данный момент в применении тумороидов все ещё существует много ограничений (дороговизна методов, большое количество образцов биопсии, трудоёмкость). Чтобы преодолеть эти сложности, необходимо продолжать исследования в области органоидов и тумороидов для более быстрого интегрирования этих моделей в терапию [79].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стремительное развитие модели тумороидов КРР позволило успешно создавать биобанки с опухолевыми органоидами, изучать опухолеобразование и метастазирование в фундаментальных и прикладных исследованиях. Различные биоинформатические анализы (в частности, полногеномное и транскриптомное секвенировние) высоко гетерогенных опухолей, возникающих у пациентов при колоректальном раке, были успешно проведены на тумороидах, что позволяет использовать данную модель для скрининга лекарств и подбора максимально эффективной терапии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

About the authors

Maria G. Krasnova

Research Centre for Medical Genetics

Author for correspondence.
Email: krasnova.m.g.0605@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-2195-3025
SPIN-code: 9339-9163
Russian Federation, Moscow

Anna S. Efremova

Research Centre for Medical Genetics

Email: krasnova.m.g.0605@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5035-6396
SPIN-code: 6006-8355

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

Tatiana B. Bukharova

Research Centre for Medical Genetics

Email: krasnova.m.g.0605@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0481-256X
SPIN-code: 2092-5580

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

Natalia Y. Kashirskaya

Research Centre for Medical Genetics; M.F. Vladimirsky Moscow Regional Clinical Research Institute (MONIKI)

Email: krasnova.m.g.0605@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0503-6371
SPIN-code: 3628-2500

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

Aleksey S. Tsukanov

National Medical Research Center of Coloproctology named after A.N. Ryzhikh

Email: krasnova.m.g.0605@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8571-7462
SPIN-code: 4005-0998

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Nina A. Gorban

Research Centre for Medical Genetics; Central Clinical Hospital with a Polyclinic Department at the Administration of the President of the Russian Federation

Email: perovanina@mail.ru

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Dmitry S. Mikhaylenko

Research Centre for Medical Genetics; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: mikhaylenkods@med-gen.ru
ORCID iD: 0000-0001-9780-8708
SPIN-code: 2083-9060

MD, Cand. Sci. (Med.), Associate Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

Vladimir V. Strelnikov

Research Centre for Medical Genetics

Email: vstrel@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-9283-902X
SPIN-code: 9118-7267

Dr. Sci. (Biol.), Associate Professor

Russian Federation, Moscow

Dmitry V. Goldshtein

Research Centre for Medical Genetics

Email: dvgoldshtein@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2438-1605
SPIN-code: 7714-9099

Dr. Sci. (Biol.), Professor

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files