A comparative study on morphology of corneal endothelium and Descemet membrane, TGF-β1 aqueous humor level in Fuchs endothelial corneal dystrophy and pseudophakic bullous keratopathy

Full Text

Сравнительный анализ структуры эндотелия[*] и десцеметовой мембраны роговицы, уровня TGF-β1 во внутриглазной жидкости при эндотелиальной дистрофии Фукса и псевдофакичной буллёзной кератопатии

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что эндотелий (в некоторых публикациях используют термин «задний эпителий») роговицы — это монослой высокодифференцированных клеток преимущественно гексагональной формы, плотно прилежащих друг к другу и расположенных на десцеметовой мембране (ДМ) [1]. Клеточный цикл эндотелиоцитов in vivo остановлен в G1-фазе, что обусловлено механизмом контактного торможения и ингибирующим действием биологически активных веществ внутриглазной жидкости (ВГЖ) [2]. Эндотелиальные клетки (ЭК) характеризуются выраженной метаболической активностью и высокой плотностью ионных каналов. Так, трансмембранный перенос веществ формирует осмотическое давление, обеспечивающее поддержание динамического равновесия между притоком ВГЖ в строму и её оттоком в переднюю камеру. Различные типы межклеточных соединений эндотелиального слоя формируют эффективный барьер между экстрацеллюлярным матриксом (ЭЦМ) стромы и влагой передней камеры. Снижение плотности ЭК приводит к накоплению ВГЖ в строме, разрушению базальной мембраны и появлению микрокист эпителия, то есть к развитию буллёзной кератопатии (БК) [3].

Буллёзная кератопатия может быть обусловлена ускоренной гибелью ЭК из-за их повреждения при различных интраокулярных хирургических вмешательствах, например экстракции катаракты (псевдофакичная БК), на фоне локального воспалительного процесса или может быть признаком несостоятельности кератотрансплантата [4, 5].

Среди причин снижения плотности ЭК также выделяют генетически детерминированные патологические изменения эндотелия и ДМ. К ним относится эндотелиальная дистрофия Фукса (ЭД Фукса), для которой характерна клиническая картина cornea guttata: при биомикроскопии переднего отрезка глаза на задней поверхности роговицы, между ЭК, визуализируются каплевидные образования различного размера — гутты. Увеличение числа гутт приводит к гибели ЭК и как следствие — к хроническому отёку роговицы [6]. В экспериментально-клинических исследованиях показано, что гутты представляют собой зоны накопления ЭЦМ, а их появление связано со сдвигом морфологического типа и функционального статуса ЭК в фибробластоподобную сторону — эпителиально-мезенхимальной трансформацией (ЭМТ). При этом ЭК под влиянием различных факторов (в том числе трансформирующего фактора роста β1, transforming growth factor β1 — TGF-β1) синтезируют избыточное количество компонентов ЭЦМ — фибронектина, коллагена I и III типов и др. [7–9].

Таким образом, с учётом представленных особенностей патогенеза ЭД Фукса и псевдофакичной БК актуальны детальное изучение структурных изменений эндотелия и ДМ роговицы, а также оценка уровня TGF-β1 во ВГЖ передней камеры глаза при этих заболеваниях.

Цель исследования — сравнение морфологических изменений эндотелия и десцеметовой мембраны роговицы, а также уровня TGF-β1 во внутриглазной жидкости при эндотелиальной дистрофии Фукса и псевдофакичной буллёзной кератопатии.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследование включены 35 пациентов (36 глаз) с хроническим отёком роговицы, обусловленным необратимым нарушением функций ЭК. Всем больным проведена селективная кератопластика (трансплантация донорской ДМ и эндотелия (ДМ-Э) роговицы) в ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней имени М.М. Краснова». Все пациенты перед началом исследования подписывали информированное согласие.

Сформированы 4 группы исследования: 1а, 1б, 2а, 2б — и 2 контрольные группы. Группу 1а составили 12 пациентов (12 глаз) с диагнозом ЭД Фукса, группу 1б — 10 больных (10 глаз) с псевдофакичной БК. У пациентов этих групп во время операции через парацентез роговицы были получены образцы ВГЖ (100–150 мкл), которые затем хранили при температуре –80 °С. Концентрацию TGF-β1 в этих образцах определяли методом твёрдофазного иммуноферментного анализа (табл. 1), используя реагенты тест-системы Mini Samples ELISA Kit for TGF-β1 (Cloud-Clone Corp., США). Детекцию сигнала выполняли на фотометре Muliscan FC (Thermo Fisher Scientific, США) при длине волны 450 нм. Проведено гистологическое исследование образцов ДМ-Э, удалённых при кератопластике у пациентов групп 1а и 1б.

 

Таблица 1. Oбщая характеристика материала и методов исследования

Характеристики	ЭД Фукса 1а группа	ПБК 1б группа	Контроль	ЭД Фукса 2а группа	ПБК 2б группа	Контроль
Количество пациентов/доноров	12	10	5	8	5	7
Количество глаз	12	10	5	9	5	7
Пол, м/ж	3/9	5/5	2/3	3/5	4/1	5/2
Возраст, лет, M±m	76,0±7,9	68,1±12,6	69,2±11,7	68,6±12,6	72,4±11,4	71,3±8,4
Толщина роговицы в центральной зоне до операции, мкм, M±m	757,9±98,7	774,6±57,0	—	701,4±46,9	748,6±59,8	—
Материал и методы исследования	Твёрдофазный иммуноферментный анализ образцов внутриглазной жидкости (концентрация TGF-β1)		—	Иммунофлуоресцентный анализ десцеметовых мембран с задним эпителием (окрашивание на ZO-1, α-SMА, контрастирование ядер клеток Hoechst 33342)
	Гистологическое исследование парафиновых срезов десцеметовых мембран с задним эпителием (окрашивание гематоксилином и эозином)

Примечание: ЭД Фукса — эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса; ПБК — псевдофакичная буллёзная кератопатия; TGF-β1 — transforming growth factor β1; ZO-1 — zonula occludens-1; α-SMА — α-smooth muscle actin.

 

В качестве контроля использовали 5 образцов ДМ-Э, выделенных из донорских корнеосклеральных дисков (срок хранения в консервационной среде Борзенка–Мороз — 2±1 сут, глазной тканевой банк ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней имени М.М. Краснова»). Материал фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, заливали в парафин и готовили серийные срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином (см. табл. 1). Срезы визуализировали на световом микроскопе Leica DM-2500 (Leica Microsystems, Швейцария) с фотокамерой Leica DFC 295 (Leica Microsystems, Швейцария). Морфометрический анализ структуры ДМ проводили в программе Leica Application Suite V4.8 (Leica Microsystems, Швейцария). Дифференциацию переднего «полосатого» и заднего «неполосатого» слоёв выполняли на основании особенностей окрашивания гематоксилином и эозином [10]. Полученные результаты толщины каждого из слоёв представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Статистически значимыми считали различия при p <0,05 (U-критерий Манна–Уитни, SPSS Statistics 26.0).

Группу 2а составили 8 пациентов (9 глаз) с диагнозом ЭД Фукса, группу 2б — 5 больных (5 глаз) с псевдофакичной БК. У всех пациентов при кератопластике были получены комплексы ДМ-Э. В качестве контроля использовали 7 образцов ДМ-Э, выделенных из донорских корнеосклеральных дисков (срок хранения в консервационной среде Борзенка-Мороз — 2±1 сут, глазной тканевой банк ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней имени М.М. Краснова») (см. табл. 1). Для иммунофлуоресцентного исследования плоскостных препаратов ДМ-Э все образцы фиксировали 10% нейтральным раствором формалина сразу после получения. После пермеабилизации и блокировки неспецифического связывания проводили двухступенчатое окрашивание. Первичные антитела к белку плотных межклеточных контактов zonula occludens-1 — ZO-1 (Thermo Fisher Scientific, США) — и к α-гладкомышечному актину (α-smooth muscle actin) — α-SMA (Thermo Fisher Scientific, США) — использовали в разведении 1:100, инкубировали в течение 8 ч при температуре 4 °С. В качестве флуоресцентной метки применяли вторичные антимышиные антитела Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific, США) в разведении 1:750. Контрастирование ядер ЭК осуществляли красителем Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific, США) в концентрации 1 мкг/мл (см. табл. 1). Визуализацию выполняли на инвертированном микроскопе Zeiss Axio Vert.A1 (Carl Zeiss, Германия) в режиме детекции флуоресценции и фазового контраста. Обработку изображений, полученных при фотофиксации (фотоаппарат Canon EOS 700D, Япония), осуществляли с помощью программного пакета CorelDraw и ImageJ. Полученные данные представлены в виде медианы и квартилей (Me [Q1; Q3]). Статистически значимыми считали различия при p <0,05 (U-критерий Манна–Уитни, GraphPad Prism).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ содержания TGF-β1 в ВГЖ свидетельствует о его статистически значимом повышении у пациентов группы 1а (ЭД Фукса) по сравнению с пациентами группы 1б (псевдофакичная БК) (рис. 1).

 

Рис. 1. Концентрация TGF-β1 (пг/мл) во внутриглазной жидкости при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса и псевдофакичной буллёзной кератопатии.

 

Световая микроскопия парафиновых срезов ДМ-Э пациентов контрольной группы показала, что ДМ состоит из заднего «неполосатого» слоя (толщина — 9,40±2,53 мкм) и переднего «полосатого» слоя (толщина — 2,61±0,64 мкм). Стромальная поверхность ДМ представлена зоной плотного ЭЦМ (рис. 2, а).

 

Рис. 2. Десцеметовы мембраны: a — в условиях физиологической нормы, контроль; б — при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса; в — при псевдофакичной буллёзной кератопатии. Эндотелиальные клетки (красные стрелки), эндотелиальная поверхность ДМ (чёрные стрелки), стромальная поверхность ДМ (зелёные стрелки); гутты (звёздочки); А — постнатальные слои; Б — пренатальный передний «полосатый» слой. Окраска гематоксилином и эозином; ×200.

 

При гистологическом исследовании образцов ДМ-Э пациентов группы 1а (ЭД Фукса) во всех случаях выявлены единичные ЭК, прилежащие к ДМ. Последняя представлена синтезированными в постнатальном периоде задним «неполосатым» слоем, коллагеновой зоной и гуттами (каплевидными разрастаниями ЭЦМ), суммарная толщина всех слоёв составила 16,56±2,25 мкм. Ближе к стромальной поверхности ДМ определяются менее интенсивно окрашенный гематоксилином и эозином её передний «полосатый» слой толщиной 3,06±0,17 мкм и зона плотного ЭЦМ (рис. 2, б).

В образцах пациентов группы 1б (псевдофакичная БК) световая микроскопия образцов ДМ-Э не выявила наличия ЭК, что, вероятно, связано с их более слабой адгезией к ДМ и потерей на этапе получения срезов. ДМ в этой группе состоит из заднего «неполосатого» слоя (7,86±0,88 мкм) и переднего «полосатого» слоя (3,0±0,32 мкм). Стромальная поверхность ДМ представлена плотным ЭЦМ (рис. 2, в).

Результаты проведённого гистологического исследования подтверждают, что при ЭД Фукса патологический процесс затрагивает ДМ, приводя к её морфологическим изменениям, а именно к увеличению толщины зоны, синтезированной в постнатальном периоде (состоящей из заднего «неполосатого» и коллагенового слоёв, а также гутт). В то же время при анализе образцов ДМ с псевдофакичной БК нет значимых различий в её структуре по сравнению с контролем.

Анализ состояния эндотелия в образцах ДМ-Э пациентов групп 2а и 2б, а также контроля проведён иммунофлуоресцентным методом (световой микроскопией в режиме детекции флуоресценции и фазового контраста).

Так, в плоскостных препаратах ДМ-Э, относящихся к контрольной группе, определяется монослой полигональных ЭК. Межклеточные контакты сохранены, отмечена выраженная продукция белка ZO-1 всеми ЭК. Ядра имеют округлую форму (соотношение сторон составляет 0,92 [0, 82; 0, 96]), их площадь равна 78,40 [66, 99; 93, 24] мкм² (рис. 3, а; рис. 4, а, б).

 

Рис. 3. Эндотелий и десцеметова мембрана: a — в условиях физиологической нормы, контроль; б — при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса; в — при псевдофакичной буллёзной кератопатии. Съёмка в режиме детекции флуоресценции (межклеточные контакты окрашены в красный цвет, ядра — в синий цвет) и фазового контраста (гутты отмечены белыми звёздочками); ×200.

 

Рис. 4. Характеристика ядер эндотелиальных клеток: a — площадь, б — соотношение сторон. Контроль — зелёный цвет, эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса — фиолетовый цвет, псевдофакичная буллёзная кератопатия — коричневый цвет.

 

При изучении структуры образцов ДМ-Э во всех случаях у пациентов группы 2а (ЭД Фукса) в режиме фазового контраста визуализировано большое количество гутт различного размера, расположенных между ЭК. Межклеточные контакты на месте гутт разрушены и, по данным иммунофлуоресцентного анализа, выявлено выраженное снижение количества ЭК, синтезирующих белок ZO-1. Кроме того, отмечено увеличение площади ЭК (феномен «распластывания», возникающий при нарушении целостности монослоя эндотелия в отсутствие способности клеток к делению in vivo) (рис. 3, б). Морфометрический анализ ядер ЭК свидетельствует об увеличении их площади (79,77 [62, 51; 107, 58] мкм²) при ЭД Фукса по сравнению с контролем (p <0,05) (см. рис. 4, а). Ядра имеют вытянутую форму, соотношение их сторон ниже (0,66 [0, 53; 0, 78]), чем в контрольных образцах ДМ-Э (p <0,05) (см. рис. 4, б). Они оттеснены к периферии клеток, вероятно за счёт деформации цитоскелета и цитоплазматических мембран ЭК, вызванной ростом гутт (см. рис. 3, б).

Результаты иммунофлуоресцентного анализа образцов ДМ-Э, выполненного после их окрашивания антителами к α-SMA, свидетельствуют о высоком уровне синтеза этого белка эндотелием роговицы при ЭД Фукса (рис. 5).

 

Рис. 5. Эндотелий и десцеметова мембрана при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Съёмка в режиме детекции флуоресценции (микрофиламенты α-SMA окрашены в красный цвет, ядра — в синий цвет) и фазового контраста (гутты отмечены белыми звездочками); ×200.

 

По данным световой микроскопии ДМ-Э (режим детекции флуоресценции), во всех случаях у пациентов группы 2б (псевдофакичная БК) определяется низкая плотность ЭК по сравнению с контролем. Как и в образцах ДМ-Э пациентов группы 2а (ЭД Фукса), межклеточные контакты разрушены, отмечено значимое уменьшение числа ЭК, синтезирующих белок ZO-1. Кроме того, микроскопическая картина эндотелия подтверждает, что при псевдофакичной БК, как и при ЭД Фукса, размеры ЭК увеличены по сравнению с контролем (рис. 3, в). Морфометрический анализ ядер показывает, что их площадь составляет 154,11 [120, 73; 203, 13] мкм², что превышает аналогичные показатели в образцах ДМ-Э группы 2а и контроля (p <0,05) (см. рис. 4, а). Ядра имеют округлую форму, соотношение их сторон ниже (0,60 [0, 50; 0, 69]), чем в контрольных образцах (p <0,05) (см. рис. 4, б).

ОБСУЖДЕНИЕ

Со второй половины XX века ведётся анализ возрастных и патологических изменений ДМ роговицы человека с использованием различных морфологических методов исследования [11–15]. По данным электронной микроскопии, в интактной ДМ выделяют пренатальный передний «полосатый» и постнатальный задний «неполосатый» слои. «Полосатый» слой сформирован к моменту рождения, имеет толщину 3 мкм и характеризуется специфической исчерченностью. На протяжении последующего постнатального периода ЭК роговицы секретируют новые компоненты ЭЦМ, из которых формируется задний «неполосатый» слой ДМ толщиной около 10 мкм [16].

Выполненный нами морфометрический анализ парафиновых срезов образцов ДМ пациентов с псевдофакичной БК и выделенных из донорских корнеосклеральных дисков (контрольная группа) показал сходные результаты с ранее представленными, несмотря на сложность в определении истинной границы между слоями по интенсивности их окрашивания гематоксилином и эозином. Статистически значимых различий в параметрах ДМ между псевдофакичной БК и контролем не отмечено. Таким образом, можно заключить что псевдофакичная БК, возникающая вследствие необратимого снижения плотности ЭК, не сопровождается структурными изменениями ДМ.

Вместе с тем показано статистически значимое утолщение ДМ при ЭД Фукса по сравнению с псевдофакичной БК и контролем за счёт синтеза в постнатальном периоде заднего «неполосатого» слоя (состоящего преимущественно из компонентов ЭЦМ), коллагеновой зоны и гутт. Полученные результаты согласуются с данными W.M. Bourne и соавт. [11], которые впервые выполнили детальный анализ строения ДМ при ЭД Фукса и на основании электронограмм ДМ показали, что передний «полосатый» слой остаётся интактным, рост заднего «неполосатого» слоя замедляется, в то же время постепенно формируются дополнительный коллагеновый слой и гутты, суммарная толщина которых в среднем равна 16,6 мкм. N. Okumura и соавт. [9] методом световой микроскопии парафиновых срезов роговиц (окрашивание гематоксиином и эозином) выявили статистически значимое утолщение ДМ при ЭД Фукса по сравнению с контролем.

Однако T. Brockmann и соавт. [10], использовав аналогичный метод морфологического исследования образцов ДМ пациентов с клинической картиной ЭД Фукса и БК, не обнаружили статистически значимых различий в толщине ДМ и её слоев между группами. Возможно, это связано с включением в исследование пациентов с менее выраженной фенотипической картиной ЭД Фукса, что подтверждают данные пахиметрии центральной зоны роговицы (666±69 мкм). Вместе с тем авторами отмечено наличие гутт как признак атипичного строения ДМ при ЭД Фукса.

Как известно, ЭД Фукса относят к мультигенным заболеваниям, связанным с вовлечением различных локусов и имеющим популяционную вариабельность [17]. В настоящее время проводятся экспериментально-клинические исследования, направленные на изучение взаимосвязи между молекулярно-генетическими и структурными изменениями [9, 18–20]. Так, выявлены мутантные аллели в генах ZEB1 и TCF4, которые кодируют белки ZEB1 и Е2-2 — факторы, инициирующие процесс ЭМТ. Иммуногистохимический анализ ДМ-Э и полнослойных роговиц выявил выраженную продукцию TGF-β1 в ЭК и гуттах при ЭД Фукса [9, 19–21]. Подобная картина подтвердила предположение об ЭМТ клеток эндотелия с приобретением ими фибробластоподобного фенотипа. Проведённые N. Okumura и соавт. [9] исследования показали, что в иммортализованной культуре ЭК, выделенной из ДМ-Э пациентов с ЭД Фукса при кератопластике, повышена экспрессия генов ZEB1 и Snail-1. Кроме того, авторами была обнаружена продукция компонентов ЭЦМ (коллаген I, IV и VIII типов, фибронектин). Экспозиция в течение 24 ч культуры ЭК с раствором TGF-β1 способствовала увеличению выраженности перечисленных выше изменений. Авторы предположили, что существует взаимосвязь между уровнем TGF-β1 во ВГЖ и степенью ЭМТ ЭК с продукцией компонентов ЭЦМ и ростом гутт [9].

Для изучения этой взаимосвязи нами проведён анализ концентрации TGF-β1 во ВГЖ. Статистически значимое повышение уровня этого биологически активного эндогенного вещества при ЭД Фукса по сравнению с псевдофакичной БК согласуется с результатами M. Matthaei и соавт. [22], которые показали, что при ЭД Фукса в стадии декомпенсации в ВГЖ определяется высокий уровень TGF-β1, TGF-β2 и других медиаторов ЭМТ.

При световой микроскопии плоскостных препаратов ДМ-Э в режиме детекции флуоресценции нами установлено, что при ЭД Фукса и псевдофакичной БК в одинаковой степени снижена продукция ЭК белка ZO-1, что свидетельствует о разрушении межклеточных контактов. Увеличение размеров этих клеток и их ядер в обоих случаях, очевидно, связано с попыткой эндотелия закрыть дефект слоя за счёт распластывания в отсутствие способности клеток к митотическому делению.

Ранее при использовании различных методов исследования (прижизненные зеркальная микроскопия и конфокальная микроскопия роговицы, а также иммунофлуоресцентный анализ) описаны деформация и гибель ЭК на фоне непрерывного роста гутт при ЭД Фукса [9, 23]. Вместе с тем данных об изменении формы ядер ЭК на фоне этого процесса в доступной литературе нами не обнаружено. Проведённый морфометрический анализ показал статистически значимое уменьшение соотношения сторон ядер при ЭД Фукса и псевдофакичной БК по сравнению с контролем. Несмотря на то, что визуально ядра ЭК в образцах ДМ-Э пациентов с ЭД Фукса имеют более вытянутую форму, чем при псевдофакичной БК, статистически значимых различий в соотношении сторон между этими группами не выявлено.

Возможность наложения картин, полученных при световой микроскопии в режимах детекции флуоресценции и фазового контраста, позволяет оценить взаимное расположение ЭК и гутт. Очевидно, что накопление ЭЦМ, проявляющееся неуклонным увеличением площади гутт, приводит к давлению на цитоплазматическую мембрану и цитоскелет ЭК, что проявляется в том числе деформацией ядер и их смещением к периферии ЭК. В то же время данные изменения могут отражать процесс постепенного перехода фенотипа ЭК в фибробластоподобный. Выраженный синтез клетками белка α-SMA (компонента ЭЦМ) также служит доказательством их ЭМТ. Однако требуется проведение дополнительных исследований с увеличением количества образцов ДМ-Э в каждой из основных групп для сравнительной оценки состояния ЭЦМ при ЭД Фукса и псевдофакичной БК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В основе хронического отека роговицы, возникающего при эндотелиальной дистрофии Фукса (стадия декомпенсации) и псевдофакичной буллёзной кератопатии, лежат различные изменения десцеметовой мембраны и эндотелия. Эндотелиальная дистрофия Фукса характеризуется утолщением десцеметовой мембраны за счёт синтеза фибробластоподобными клетками эндотелия волокон компонентов экстрацеллюлярного матрикса, формирующих гутты. Рост гутт вызывает нарушение межклеточного взаимодействия и деформацию ядер эндотелиальных клеток. Псевдофакичная буллёзная кератопатия не сопровождается утолщением десцеметовой мембраны. Отмечены потеря межклеточных контактов и более выраженное, чем при эндотелиальной дистрофии Фукса, увеличение ядер клеток. TGF-β1 вовлечён в патологический процесс накопления внеклеточного матрикса и формирования гутт при эндотелиальной дистрофии Фукса.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Не указан.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

 

[*] Под термином «эндотелий» здесь и далее подразумевается задний эпителий роговицы — однослойный плоский эпителий нейроглиального типа.

About the authors

Yusef N. Yusef

M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases; I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: natfisenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4043-456X
SPIN-code: 6891-6138

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

Anastasia M. Subbot

M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases

Email: kletkagb@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8258-6011
SPIN-code: 3898-2570

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Natalia V. Fisenko

M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases

Author for correspondence.
Email: natfisenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7198-4498
SPIN-code: 9750-1529

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Grigory A. Osipyan

M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases

Email: gregor79@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1056-4331
SPIN-code: 1039-0470

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Tatiana A. Demura

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: demura-t@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6946-6146
SPIN-code: 2198-5765

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files