The optimization of methods for the establishment of heterogeneous three-dimensional cellular models of breast cancer

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Культивирование клеток в лабораторных условиях позволяет решать широкий спектр медико-биологических задач: от тестирования потенциальных терапевтических агентов до сложных разработок тканевой инженерии [1, 2]. Усовершенствование питательных сред и добавок, культурального пластика и экзогенных каркасов, а также разработка новых способов визуализации живых клеток позволяют приближать 3D-клеточные модели к полноценной тканевой модели. Современные гетерогенные 3D-структуры могут одновременно включать в себя клетки различного гистологического происхождения для имитации тканевой архитектоники, а условия культивирования таких моделей усложняются по сравнению с традиционными 2D-моделями. Можно выделить два основных подхода к культивированию клеток в 3D-моделях: с использованием субстратов, например гидрогелей; или с применением планшетов с неадгезивным покрытием без дополнительных субстратов [3].

Для гидрогелей характерна мягкая и эластичная консистенция, низкое поверхностное натяжение и высокое содержание воды, что делает их подходящей основой для формирования многоклеточных 3D-структур [3]. Источником для получения гидрогелей могут быть как природные, так и синтетические материалы либо их смесь, что обеспечивает широкий спектр химических и механических свойств таких субстратов. Природными материалами, используемыми для гидрогелей, являются коллаген, желатин, альгинат, фибрин, гиалуроновая кислота, агароза, хитозан и др. Среди коммерчески доступных готовых гидрогелей широко используют Matrigel™, в состав которого входят белки внеклеточного матрикса [4–6]. Для формирования 3D-клеточных структур чаще всего суспензию клеток высевают на поверхность гидрогеля после его полимеризации или смешивают с жидким гидрогелем для дальнейшего совместного затвердевания [7].

Ещё один подход к 3D-культивированию клеток — использование культурального пластика с низкими адгезивными свойствами [8]. Дно лунок культуральных планшетов покрывают биополимерами, такими как 2-гидроксиэтилметакрилат, полиэтиленгликоль или хитозан, для предотвращения адгезии клеток к поверхности пластика, что приводит к вынужденной агрегации клеток в сфероиды [8]. Этот метод является одним из старейших подходов к формированию трёхмерных клеточных структур.

Несмотря на разнообразие подходов к 3D-культивированию клеток, все они не лишены определённых недостатков. Во-первых, не существует универсальных стандартизированных методов культивирования любых клеток в виде 3D-моделей и успешное воспроизводство таких моделей всё ещё требует высокого мастерства. Во-вторых, необходима разработка алгоритмов с определением ключевых факторов культивирования, позволяющих формировать гетерогенные 3D-модели из разного типа клеток.

Цель исследования — сравнение простых гидрогелей (агарозы, желатина и Matrigel™) в качестве субстратов для формирования опухолевых, стромальных и гетерогенных сфероидов из клеточных линий рака молочной железы, оценка эффективности формирования сфероидов при использовании культурального пластика с низкими адгезивными свойствами от разных производителей и оптимизация условий приготовления препаратов из сформированных 3D- и 3D-2-структур рака молочной железы для микроскопического анализа.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры

Для создания клеточных 3D-моделей рака молочной железы (РМЖ) использовали опухолевые клетки линии MCF7 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург); клетки линии MDA-MB-231 (Российская коллекция клеточных культур, «ЦВТ ХимРар», Москва); клетки линии SK-BR-3, любезно предоставленные д.б.н., профессором С.М. Деевым (ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва); линии стромальных фибробластов BrC4f, BrC120f, ранее полученные из опухолевых образцов ткани РМЖ пациентов, и BN120f, выделенные из нетрансформированной (здоровой) ткани молочной железы; клеточные линии MCF7, MDA-MB-231 и SK-BR-3, продуцирующие красный флуоресцентный белок (mKate2); культуру клеток BrC120f, продуцирующих зеленый флуоресцентный белок — eGFP (коллекция лаборатории биотехнологии, Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, Новосибирск) [9, 10]. Клетки культивировали в разных питательных средах: MCF7 и фибробласты BrC4f, BrC120f, BN120f — в среде IMDM (Gibco, Великобритания); MDA-MB-231 — в среде L-15 (Gibco, Великобритания); SK-BR-3 — в среде DMEM/F12 (Gibco, Великобритания). Питательные среды для культивирования клеток содержали 10% эмбриональной фетальной сыворотки коров — FBS (Gibco, США), 2 мМ L-глутамина (Gibco, США), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В (Gibco, США). Все клеточные культуры культивировали в Т25 флаконах (TPP, Швейцария) в стандартных условиях (37,0±1,0 °С; 5,0±0,5% СО₂), в CO₂-инкубаторе (Heraeus Heracell, Германия).

При достижении конфлюэнтного монослоя клетки снимали с подложки с помощью фермента TrypLE™ (Gibco, США) и пересевали в соотношении 1:3–1:4 (v:v). Количество живых клеток считали на приборе LUNA-II™ (Logos Biosystems, Южная Корея) после окраски трипановым синим (Logos Biosystems, Южная Корея). Формирование и культивирование сфероидов проводили в двух режимах в стандартных условиях: 1) режим монокультивирования, при котором сфероид формировался только из опухолевых или только из стромальных культур клеток (3D-модель РМЖ); 2) режим сокультивирования опухолевых и стромальных клеток (3D-2-модель РМЖ). Формирование сфероидов анализировали каждые 24 ч на протяжении 10 сут. Клетки ресуспендировали в питательной среде в зависимости от режима и техники культивирования. В режиме монокультивирования опухолевые или стромальные клетки высевали в количестве 1×10³ клеток на лунку. В режиме сокультивирования опухолевые клетки и фибробласты высевали в соотношении 1:1 или 1:4 (5×10² опухолевых клеток и 5×10² или 2×10⁴ стромальных клеток на лунку).

Сфероиды получали в двух вариантах культивирования в обоих режимах: на подложке из простых гидрогелей или при культивировании на низкоадгезивном пластике. В случае использования субстрата из природного гидрогеля дно лунки 96-луночного планшета (TPP, Швейцария) предварительно покрывали водным раствором 2% желатина из кожи северных рыб (Sigma, Канада), 2% агарозой (Amresco, США), растворённой в фосфатно-солевом буфере (PBS), или Matrigel™ (Corning, США) для формирования подложки. С целью полимеризации гидрогеля планшет помещали в термостат на 30 мин при температуре 37,0±1,0 °С. На сформированную подложку из гидрогеля переносили суспензию клеток в питательной среде RPMI-1640 (Gibco, Великобритания), содержащей 2% FBS, для последующего культивирования при стандартных условиях.

Поскольку известно, что планшеты и чашки разных производителей из культурального пластика с низкими адгезивными свойствами могут отличаться по эффективности культивирования 3D-структур, был проведён сравнительный анализ эффективности культивирования 3D-моделей РМЖ с использованием пластика двух производителей: Eppendorf (Eppendorf, Германия) и Nunclon™ Sphera™ (Thermo Fisher Scientific, Япония) [11]. В процессе получения опухолевых сфероидов при использовании низкоадгезивного пластика возможно культивирование в бессывороточной питательной среде, дополненной различными добавками для поддержания жизнеспособности и пролиферации клеток [8, 12, 13]. Типичный протокол [8, 14–16] включает суспендирование клеток в бессывороточной среде DMEM/F12 [17], содержащей добавки эпидермального фактора роста (EGF) [18], основного фактора роста фибробластов (bFGF) [19, 20], инсулина [21], B-27™ Plus Supplement (Gibco, США) [15] и бычьего сыворочного альбумина (BSA) [22].

При использовании низкоадгезивного пластика клетки культивировали в лунках 96-луночного планшета Eppendorf или Nunclon™ Sphera™ при стандартных условиях в бессывороточной среде DMEM/F12, содержащей 20 нг/мл EGF (Sigma-Aldrich, Германия), 20 нг/мл bFGF (Gibco, США), 5 мкг/мл инсулина (Sigma-Aldrich, Германия), 2% B-27™ Plus Supplement и 0,4% BSA (Amresco, США).

Приготовление препаратов для микроскопического анализа

Препараты для микроскопического анализа готовили в двух вариантах: используя в работе наконечники, растворы и культуральный планшет со сфероидами без охлаждения дна или охлаждёнными. Для охлаждения дна планшета применяли хладоэлемент, поддерживающий температуру –20 °С.

Полученные сфероиды отмывали от культуральной среды раствором PBS при комнатной температуре или предварительно охлаждённым до 4 °С, переносили на предметные стёкла с адгезивным покрытием (поли-L-лизин; Thermo Fisher Scientific, США) с помощью наконечника, хранившегося при комнатной температуре или предварительно охлаждённого в морозильной камере при –20 °С, накрывали покровным стеклом и осторожно надавливали на них [23]. Процессы формирования и роста сфероидов, а также «раздавленные препараты» визуализировали с помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа Nikon серии Eclipse Ti-S (Nikon, Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сравнительный анализ эффективности использования простых гидрогелей и пластика с низкими адгезивными свойствами для формирования 3D- и 3D-2-моделей рака молочной железы

При сравнении эффективности применения простых гидрогелей для формирования гомогенных 3D- и гетерогенных 3D-2-моделей РМЖ (рис. 1) обнаружено, что на субстрате из 2% желатина не удалось получить 3D- и 3D-2-структуры РМЖ ни для одной из используемых в работе культур клеток (рис. 1, а).

 

Рис. 1. 3D- и 3D-2-модели рака молочной железы, сформированные при культивировании клеток в двух режимах: а — 2% желатин; б — 2% агароза; в — Matrigel™; 10 сут культивирования.

 

Гидрогель на основе 2% агарозы способствовал формированию 3D-структур из стромальных клеток, в случае опухолевых клеток лучшее формирование сфероидов отмечено для клеток SK-BR-3 и с меньшей эффективностью — для клеток MCF7 (рис. 1, б). Клетки MDA-MB-231 находились в состоянии суспензии — без прикрепления к субстрату и распластывания и без формирования 3D-структур. Использование смеси опухолевых и стромальных клеток на подложке из агарозы позволило получить 3D-2-структуры различной плотности: с хорошо структурированным ядром и более рыхлым внешним окружением. Таким образом, формирование 3D-структур на подложке из агарозы характерно для фибробластов или смеси фибробластов и опухолевых клеток.

Высевание суспензии клеток на подложку из Matrigel™ показало, что как фибробласты, так и опухолевые клетки формируют 3D-структуры (рис. 1, в). Основное отличие между получаемыми 3D-структурами заключалось в том, что фибробласты формировали не свободно плавающие структуры, а прикреплённые к субстрату. Гетерогенные 3D-2-сфероиды в большинстве случаев также имели признаки прикрепления к субстрату.

При использовании культурального пластика Eppendorf с низкими адгезивными свойствами не удалось получить сфероиды из стромальных клеток и опухолевых клеток MDA-MB-231 неэпителиального происхождения (рис. 2). Несмотря на заявляемую производителем низкую адгезию, фибробластоподобные клетки адгезировали к поверхности пластика и росли, что указывает на непригодность данного типа культурального пластика для получения 3D-структур из фибробластов. Сокультивирование опухолевых клеток линии SK-BR-3 позволило получить стабильные 3D-структуры со всеми стромальными клетками (см. рис. 2). Для опухолевых клеток линий MCF7 и MDA-MB-231 сокультивирование с клетками BrC4f также способствовало формированию гетерогенных сфероидов.

 

Рис. 2. Сфероиды сформированы при культивировании на низкоадгезивном пластике: А1, Б1 — Eppendorf (Eppendorf, Германия); А2, Б2 — Nunclon™ Sphera™ (Thermo Fisher Scientific, Япония).

 

При использовании культурального пластика Nunclon™ Sphera™ в случае фибробластов наблюдали как плавающие 3D-структуры, так и рост клеток в адгезивном состоянии. В случае опухолевых клеток и смеси опухолевых и стромальных клеток происходило формирование крупных плавающих одиночных 3D-структур. Можно заключить, что культуральный пластик Nunclon™ Sphera™ с низкими адгезивными свойствами наиболее пригоден для получения опухолевых и опухолево-стромальных сфероидов из клеток РМЖ (см. рис. 2).

Для подтверждения включения клеток обоих типов — опухолевых и стромальных — в состав гетерогенных сфероидов, образующихся при культивировании на планшетах Nunclon™ Sphera™, использовали линии опухолевых клеток MCF7, MDA-MB-231 и SK-BR-3, продуцирующие красный флуоресцентный белок (mKate2), и клетки BrC120f, продуцирующие зелёный флуоресцентный белок (eGFP). Флуоресцентная микроскопия показала, что в состав сфероидов входят оба типа клеток — фибробласты и опухолевые клетки (рис. 3). Фибробласты преимущественно формируют внутренний каркас, а опухолевые клетки располагаются на периферии.

 

Рис. 3. Сфероиды сформированы опухолевыми клетками, продуцирующими белок mKate2 (красный цвет), и фибробластами, продуцирующими белок eGFP (зелёный цвет). Флуоресцентная микроскопия.

 

Таким образом, среди тестируемых методов использование низкоадгезивных планшетов Nunclon™ Sphera™ оказалось наиболее эффективным для получения крупных плавающих 3D-2-структур округлой формы, состоящих из опухолевых и стромальных клеток РМЖ (табл. 1).

 

Таблица 1. Сравнительный анализ методов получения 3D- и 3D-2-моделей рака молочной железы

Субстрат	Желатин	Агароза	Matrigel™	Eppendorf	Nunclon™ Sphera™
Опухолевые 3D-модели
MCF7	–	+/–	+	+/–	+
MDA-MB-231	–	–	+	–	+
SK-BR-3	–	+	+	+/–	+
Стромальные 3D-модели
BrC4f	–	+	+/–	–	+/–
BrC120f	–	+	+/–	–	+/–
BN120f	–	+	+/–	–	+/–
Опухолево-стромальные 3D-модели
3D-2-структуры	–	+/–	+/–	+/–	+

Примечание: «–» — сфероид не формируется; «+/–» — сфероид формируется, наблюдается адгезия клеток к поверхности субстрата; «+» — сфероид формируется.

 

Оптимизация манипуляций для проведения морфологического анализа сфероидов

Помимо успешного формирования 3D- и 3D-2-клеточных структур in vitro, существует проблема сохранения их целостности при различных манипуляциях в процессе анализа сфероидов. Так, многие методы подразумевают перенос и промывку сфероидов при подготовке образцов. Например, одним из распространённых методов морфологического анализа сфероидов является получение «раздавленных» препаратов сфероидов, когда сфероид помещается на предметное стекло, которое затем накрывают покровным стеклом [23]. При этом предполагают, что расположение клеток в препарате будет соответствовать расположению клеток в сфероиде [24]. Такие препараты далее могут быть использованы для иммуноцитохимического окрашивания.

При сравнительном анализе процесса переноса сфероидов на предметное стекло и получения «раздавленных препаратов» сфероидов РМЖ при комнатной температуре и с использованием охлаждённых наконечников, растворов, а также с охлаждением дна культурального планшета обнаружено, что охлаждение способствует сохранности структуры сфероида: сохраняется округлая форма отпечатка и присутствует лишь незначительное количество отделённых от сфероида клеток (рис. 4). В случае использования наконечников и растворов комнатной температуры происходила дезагрегация сфероидов на отдельные клетки на разных стадиях — как на стадии переноса из лунки на предметное стекло, так и на стадии касания сфероида покровным стеклом, что выражалось в получении препаратов в виде отдельно лежащих клеток (см. рис. 4). Следовательно, можно заключить, что использование охлаждённого пластика и растворов является технологическим преимуществом при работе со сфероидами, растущими в отсутствие подложки.

 

Рис. 4. Препараты «раздавленных» сфероидов, полученные в стандартных условиях и в условиях охлаждения: а — охлаждение; б — комнатная температура.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Рак молочной железы — лидирующее диагностируемое онкологическое заболевание у женщин во всём мире [25]. Клеточные 2D- и 3D-модели злокачественных опухолей позволяют осуществлять их функциональное профилирование и выявлять молекулярные и клеточные механизмы, участвующие в патогенезе [26, 27].

Выбор субстрата для формирования 3D- и 3D-2-моделей РМЖ является ключевым этапом. Использование природных гидрогелей для конструирования сфероидных моделей позволяет максимально имитировать строение и свойства тканей [3]. Так, желатин получают в результате необратимого гидролиза коллагена, поэтому в биоматериалах для тканевой инженерии он способен частично выполнять функции коллагена [28, 29]. При 3D-печати «органов на чипе» часто применяют желатин как один из компонентов для создания более сложного геля с целью получения сфероидов [30, 31]. В нашем исследовании использование 2% желатина в качестве субстрата для формирования 3D- и 3D-2-моделей РМЖ не привело к формированию 3D- и 3D-2-структур (см. рис. 1). Известно, что желатиновый гидрогель обладает высокой проницаемостью для кислорода и питательных веществ [30], но не способствует агрегации клеток в сфероиды. Таким образом, наши эксперименты также подтвердили субстратную неэффективность гидрогеля на основе желатина без дополнительных компонентов для создания сфероидов из клеток РМЖ.

Агароза — биоразлагаемый, неадгезивный и нетоксичный природный полисахарид, получаемый из агара морских водорослей [32], который позволяет формировать и поддерживать архитектонику ткани за счёт возможности газообмена и проницаемости для малых молекул [32, 33]. Обычно сфероиды формируют из эпителиальных клеток. Имется не так много исследований, посвящённых получению сфероидов из стромальных клеток. Мы показали, что использование агарозы как субстрата максимально эффективно для образования сфероидов из стромальных клеток и менее эффективно для получения сфероидов из опухолевых клеток. 3D-2-модели РМЖ, сформированные на 2% агарозе, собираются в структуры различной плотности — с хорошо структурированным ядром и более рыхлым внешним окружением.

N. Kanda [34] показал, что первичные фибробласты лёгких человека способны образовывать непролиферирующие сфероиды с чёткой организацией и ориентацией клеток внутри сфероида в течение 24 ч. J. Bizik и соавт. [35] получили сфероиды из дермальных фибробластов, которые формировались в течение 24 ч и разрушались через 120 ч (авторы использовали субстрат из 0,8% агарозы). В работе Y. Tan и соавт. [36] получена 3D-модель фиброза микротканей человека из клеток первичных фибробластов кожи человека, продемонстрирована повышенная секреция ими коллагена по сравнению с фибробластами, выращенными в 2D-модели, через 7 сут культивирования в формах из 2% агарозного гидрогеля. В нашем исследовании удалось сформировать и культивировать гомо-сфероиды из фибробластов, выделенных из здоровой и опухолевой ткани молочной железы человека минимум в течение 240 ч (см. рис. 1). Подобные 3D-модели только из стромальных клеток способны имитировать фиброзный очаг в опухоли, что позволяет рассматривать их как модели для исследования противофиброзных препаратов.

Matrigel™ представляет собой смесь белков внеклеточного матрикса, в состав которого входят белки базальной мембраны из клеток опухоли мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), необходимые для поляризации, адгезии клеток и регуляции их роста [5, 37]. Высевание суспензии клеток на Matrigel™ (см. рис. 1) позволило в данном исследовании сформировать опухолевые, стромальные и опухолево-стромальные сфероиды. Однако в качестве способа последующего длительного культивирования такой метод не подходит из-за наблюдаемой адгезии клеток к субстрату для сфероидов только из фибробластов или для гетерогенных 3D-2-моделей.

Сравнение культурального пластика с низкими адгезивными свойствами c U-образным дном от двух разных производителей позволило установить, что планшеты фирмы Nunclon™ Sphera™ (см. рис. 2) являются наиболее подходящими для культивирования 3D-структур. Гидрофильное полимерное покрытие Nunclon™ Sphera™ ингибирует прикрепление клеток ко дну пластика для культивирования, блокируя белки внеклеточного матрикса, необходимые для адгезии клеток [11, 38]. C. Neeley и соавт. [11] показали, что использование пластика Nunclon™ Sphera™ оптимально для формирования и поддержания роста в виде сфероидов клеток различного гистологического происхождения, в том числе клеток аденокарциномы молочной железы MCF7. J. Mei и соавт. [39] установили, что клетки MCF7 формируют компактные и крупные сфероиды на планшетах Nunclon™ Sphera™ в присутствии 10% сыворотки, в то время как опухолевые клетки SK-BR-3 и MDA-MB-231 не образуют компактных оформленных сфероидов.

Эмбриональная сыворотка содержит некоторые компоненты внеклеточного матрикса (например, фибронектин, ламинин), которые могут способствовать адгезии клеток [17], поэтому для предотвращения прикрепления клеток к пластику нами были сформированы сфероиды в бессывороточных условиях, в питательной среде DMEM/F12, в присутствии факторов роста EGF, bFGF, инсулина, B-27™ Plus Supplement, BSA [10, 40]. Поскольку среда DMEM/F12 лишена большей части питательных веществ, для поддержания роста клеток человека и агрегации их в сфероиды in vitro также требуются дополнительные компоненты, такие как белки-переносчики (альбумин), инсулин и факторы роста [41]. Используемое в данном исследовании соотношение дополнительных компонентов и факторов роста для формирования и культивирования опухолевых сфероидов впервые описано в работах S. Johnson и соавт. [15] и P.K. Lo и соавт. [16].

Применение планшетов Nunclon™ Sphera™ в сочетании с бессывороточной средой позволило получать в лунках одиночные сфероиды. Такое формирование сфероидов из различных по происхождению клеток может упрощать последующую количественную оценку по следующим критериям: динамическое измерение диаметра сфероидов в процессе культивирования, оценка степени «округлости» сфероидов [10], а также определение количества жизнеспособных клеток и прироста популяций на разных стадиях культивирования. Так, наиболее крупные 3D-2-сфероиды РМЖ c чёткой внешней границей были сформированы опухолевыми клетками SK-BR-3 вне зависимости от типа используемых стромальных клеток, а рыхлые опухолевые и опухолево-стромальные сфероиды — из клеток MDA-MB-231. Ранее нами было описано, что фибробласты, полученные из здоровой ткани молочной железы, выступают центральным каркасом для формирования внешнего опухолевого слоя в гетерогенных 3D-2-моделях [10]. В предлагаемом исследовании мы показали, что для клеток культур MCF7 и MDA-MB-231 добавление стромальных клеток способствовало формированию более крупных и плотных структур по сравнению с 3D-моделью РМЖ (см. рис. 3). В работе J. Mei и соавт. [39] подчеркнуто, что в присутствии нормальных фибробластов кожи человека сфероиды из клеток MDA-MB-231 становятся более компактными.

Ранее [10] нами продемонстрировано, что добавление нормальных фибробластов кожи к клеткам SK-BR-3 ускоряло формирование 3D-2-структур. Размер опухолевых и гетерогенных сфероидов, выраженный через изменение объёма сфероида, уменьшался в зависимости от используемых опухолевых клеток в ряду SK-BR-3≥MCF-7>MDA-MB-231. Предложенный нами вариант сочетания пластика Nunclon™ Sphera™ и бессывороточных условий культивирования позволил получать опухолевые и опухолево-стромальные сфероиды единообразно и с высокой эффективностью для всех используемых в работе опухолевых клеток вне зависимости от типа стромальных клеток.

Новые подходы к получению и культивированию 3D-культур делают возможным создание релевантных физиологических клеточных моделей. Однако последующие трудоёмкие этапы пипетирования для манипуляций со сфероидами, такие как сбор образца для повторного переноса и множественные промывки [42] для микроскопического анализа, могут влиять на качество препарата. Для сохранности сфероидов, сформированных без каркаса из гидрогеля, при манипуляциях с ними было использовано охлаждение наконечников и растворов (см. рис. 4). Обычно охлаждение наконечников и растворов практикуют при манипуляциях с агентами, затвердевающими на фоне повышения температуры (коллаген, Matrigel™ и т.д.) [43–45]. M.G. Rolver и соавт. [46] для предотвращения потери целостности сфероидов в ходе пробоподготовки предварительно охлаждали растворы при проведении промежуточных отмывок, но без охлаждения наконечников и планшетов. Применение холодных наконечников и растворов в процессе пробоподготовки к микроскопии в предлагаемом исследовании позволило сохранить структуру сфероида.

Таким образом, хотя для получения сфероидов из монослойных культур клеток доступно несколько методов и большое количество различных протоколов [47], тем не менее эти протоколы по-прежнему противоречивы [48].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сфероиды — это распространённая система культивирования клеток многоклеточной опухолевой модели in vitro для имитации трёхмерности опухоли. В нашем исследовании сравниваются разные типы подложек из гидрогелей и планшеты с низкоадгезивным покрытием для получения трёхмерных клеточных структур. Показано, что применение только одного типа подложки из гидрогеля не позволяет получить весь спектр 3D-структур рака молочной железы: для сфероидов из фибробластов и опухолево-стромальных сфероидов больше подходит подложка из агарозы, а для опухолевых клеток — из Matrigel™. Более оптимальным методом получения 3D-2-структур, состоящих из опухолевых и стромальных клеток рака молочной железы, является использование низкоадгезивных планшетов Nunclon™ Sphera™. Предварительное охлаждение наконечников и растворов способствует сохранности структуры сфероидов при манипуляциях с ними во время пробоподготовки к микроскопии.

Предложенные подходы для формирования и гомогенных (3D), и гетерогенных (3D-2) сфероидов из опухолевых и (или) стромальных клеток рака молочной железы представляют собой обобщённое руководство по наиболее эффективному способу получения сфероидов различного клеточного состава.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 20-74-10039).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов, о которых необходимо сообщить.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

About the authors

Mariya M. Abdurakhmanova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State University

Email: nushtaeva.anna@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6557-553X
SPIN-code: 6160-7608
Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

Mikhail S. Ermakov

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: nushtaeva.anna@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7107-4187
SPIN-code: 7929-4095
Russian Federation, Novosibirsk

Vladimir A. Richter

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Email: nushtaeva.anna@gmail.com
SPIN-code: 7182-1120

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Novosibirsk

Olga A. Koval

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State University

Email: nushtaeva.anna@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7788-2249
SPIN-code: 4227-8496

Dr. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Novosibirsk; Novosibirsk

Anna A. Nushtaeva

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: nushtaeva.anna@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9367-807X
SPIN-code: 7964-9774

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Novosibirsk

References

Supplementary files