Melatonin role in formation of T helper subpopulations co-expressing Th17 and Treg markers

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Гормон мелатонин, секретируемый в основном шишковидной железой, обладает широким спектром функций, в том числе способностью эффективно регулировать активность клеток иммунной системы [1–3]. Важными мишенями действия мелатонина в иммунной системе являются Т-лимфоциты, продуцирующие IL-17, — Th17, и регуляторные Т-клетки — Treg: обе субпопуляции имеют рецепторы для мелатонина — как мембранные (МТ1/МТ2), так и внутриклеточный (RORα) — и находятся под непосредственным контролем гормона [4, 5]. Клетки Th17 играют важную роль в защите организма от экстраклеточных патогенов, в развитии воспаления, в том числе аутоиммунного, а клетки Treg, выполняя реципрокные функции, участвуют в предупреждении развития аутоиммунных, аллергических процессов и реакций отторжения трансплантата [6–10]. Однако данные субпопуляции крайне неоднородны и обладают высокой пластичностью. Так, дифференцированные Th17 способны трансформироваться в IFNγ⁺Th17⁺-клетки, так называемые Th17/Th1-клетки [11], или в Treg [12], тогда как регуляторные Т-лимфоциты при поляризующих условиях трансдифференцируются в IL-17-продуцирующие клетки [13, 14]. Механизмы пластичности наивных и зрелых клеточных популяций в полной мере не изучены, но этот процесс очень важен, поскольку именно неклассическим популяциям Th17 и Treg отводят в настоящее время ведущую роль в патогенезе различных заболеваний.

Цель исследования — оценка роли мелатонина в формировании Т-хелперных субпопуляций, одновременно синтезирующих маркёры Th17 и Treg.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использовали лейкоциты здоровых небеременных женщин (n=10, средний возраст — 38,30±1,95 года). От всех доноров получали добровольное информированное согласие на участие в исследовании, которое было одобрено Комитетом по этике Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН — филиала Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН (протокол № 15 от 20 мая 2022 г.) и проведено в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) об исследованиях с участием человека.

Лейкоциты выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла–верографина (1,077 г/см³; Pharmacia, Швеция). Из фракции мононуклеарных клеток получали Treg-обогащённую суспензию (CD4⁺CD25⁺-Т-лимфоциты) методом иммуномагнитной сепарации (R&D Systems, США). Фракционированные Т-клетки (1×10⁶ кл./мл) культивировали в течение 48 ч в среде RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Serva, Германия), 1 мМ HEPES (Sigma-Aldrich, США), 2 мМ L-глутамина (Serva, Германия) и 40 ед./мл гентамицина (Pharmacia, Швеция) при 37 °С и 5% СО₂ в двух вариантах: без активатора (спонтанный вариант) и в условиях поликлональной активации (система для активации на основе моноклональных антител к CD3/CD28; Invitrogen, США).

Синтез клетками транскрипционных факторов RORγt (маркёра дифференцировки Th17) и FOXP3 (маркёра Treg), а также внутриклеточного IL-17 определяли через 48 ч культивирования проточной цитометрией (CytoFLEX S; Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител: анти-CD4-FITC, анти-RORγt-PerCP, анти-FOXP3-PE и анти-IL-17/IL-17A-PerCP (Biolegend, Novus Biologicals, R&D Systems, США). Оценивали как количество Т-клеток, несущих данные маркёры, так и среднюю интенсивность свечения в условных единицах (mean fluorescence intensity, MFI), отражающую уровень конкретного маркёра в клетках.

Мелатонин (Sigma-Aldrich, США) вносили в культуру Т-клеток за 30 мин до активации в концентрациях, соответствующих фармакологическим уровням гормона в крови — 0,5 и 5 нг/мл [15]. Вклад мембранных мелатониновых рецепторов в реализацию эффектов гормона определяли с использованием соответствующих антагонистов — неселективного (лузиндол — для МТ1/МТ2) и селективного (4-P-PDOT – для МТ2) [16]. Их вносили в интактную и стимулированную (CD3/CD28) культуру Т-клеток за 1 ч до активации.

Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флуоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли: Mouse IgG2B-PerCP и Mouse IgG2B-PE (R&D Systems, США). Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 48 ч культивирования, составляла 95–98%.

Статистический анализ выполняли с применением парного t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование in vitro показало снижение содержания классических клеток Treg (CD4⁺FOXP3⁺-Т-клеток) в культуре интактных лимфоцитов в присутствии мелатонина (табл. 1), хотя в условиях поликлональной активации эффект гормона не выявлен. При этом блокада мембранных рецепторов для мелатонина отменяла супрессивный эффект гормона в отношении классической субпопуляции клеток Treg (количество CD4⁺FOXP3⁺-Т-клеток, спонтанный вариант: 4,510±0,847% на фоне лузиндола, 3,810±0,648% на фоне лузиндола и 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05; 4,85±1,05% на фоне 4-P-PDOT; 4,350±0,753% на фоне 4-P-PDOT и 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05). В отношении классической субпопуляции клеток Th17 (CD4⁺RORγt⁺-Т-клеток) статистически значимого действия мелатонина не обнаружено (см. табл. 1), хотя также имелась тенденция к снижению. Тем не менее баланс CD4⁺RORγt⁺/CD4⁺FOXP3⁺-Т-клеток в присутствии гормона сдвигался в направлении клеток Th17 (см. табл. 1). Этот эффект был подтверждён и ростом соотношения уровня соответствующих транскрипционных факторов в клетке, который оценивали по средней интенсивности свечения (MFI RORγt/MFI FOXP3, спонтанный вариант: 0,615±0,103 у.е. — контроль, 1,010±0,260 у.е. — на фоне 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05; 1,070±0,202 — на фоне 5,0 нг/мл мелатонина, р <0,05).

 

Таблица 1. Влияние мелатонина на дифференцировку клеток Th17 и Treg in vitro

Экспериментальные условия		Контроль	Концентрация мелатонина в культуре
			0,5 нг/мл	5,0 нг/мл
Количество CD4+RORγ	Спонтанный вариант	1,990±0,388	1,520±0,378	1,390±0,245
	Анти-CD3/CD28	13,70±3,82	12,80±2,72	14,20±3,72
Количество CD4+FOXP3+- Т-клеток, %	Спонтанный вариант	6,260±0,871	3,380±0,725*	4,470±0,926
	Анти-CD3/CD28	26,60±5,31	23,90±3,46	27,20±5,41
Количество CD4+RORγ	Спонтанный вариант	0,538±0,084	2,240±0,647*	1,350±0,482
	Анти-CD3/CD28	8,92±3,34	7,96±1,68	9,39±2,55
Соотношение CD4+RORγ	Спонтанный вариант	0,334±0,054	0,589±0,150**	0,516±0,142
	Анти-CD3/CD28	0,596±0,116	0,679±0,170	0,685±0,184

* р <0,05 при сопоставлении с контролем; **р=0,05 при сопоставлении с контролем.

 

Более детальный анализ показал, что на уровне конкретного донора эффекты мелатонина в отношении CD4⁺RORγt⁺- и CD4⁺FOXP3⁺-Т-клеток, как правило, однонаправленные, разница только в интенсивности воздействия: ингибирующее действие было выше в отношении FOXP3, а стимулирующее — для RORγt (рис. 1). По-видимому, мелатонин в данном случае регулирует ранние этапы дифференцировки клеток Th17 и Treg, общие для обеих субпопуляций [17]. В итоге преимущественное развитие получают клетки Th17. Эти результаты согласуются с полученными нами ранее данными для нефракционированной культуры интактных CD4+-Т-лимфоцитов [5, 18].

 

Рис. 1. Эффекты мелатонина в отношении дифференцировки клеток Th17 и Treg.

 

Важно отметить, что в культуре интактных Т-лимфоцитов мелатонин в фармакологической концентрации 0,5 нг/мл существенно увеличивал количество CD4⁺-T-клеток, одновременно синтезирующих маркёры как Treg (FOXP3), так и Th17 (RORγt) (см. табл. 1, рис. 2).

 

Рис. 2. Роль мелатонина в дифференцировке Т-лимфоцитов, одновременно несущих маркёры клеток Th17 и Treg.

 

Более того, соотношение уровней транскрипционных факторов RORγt/FOXP3, оцениваемых по средней интенсивности свечения, в таких клетках было повышено в присутствии гормона (MFI RORγt/MFI FOXP3 в CD4⁺RORγt⁺FOXP3⁺-Т-клетках, спонтанный вариант: 0,514±0,078 у.е. — контроль, 1,260±0,339 у.е. — на фоне 0,5 нг/мл мелатонина, р <0,05; 0,463±0,062 у.е. — на фоне 5,0 нг/мл мелатонина, р >0,05). Данный эффект подтверждался также присутствием в соответствующих пробах IL-17-продуцирующих лимфоцитов, несущих маркёр регуляторных клеток FOXP3, и тенденцией к повышению количества этих клеток на фоне мелатонина (количество CD4⁺IL-17⁺FOXP3⁺-Т-клеток, спонтанный вариант, n=4: 0,723±0,161% — контроль, 3,240±0,941% — на фоне 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05; 1,670±0,441% — на фоне 5,0 нг/мл мелатонина, р >0,05). Строго говоря, такая неклассическая субпопуляция может быть результатом как редифференцировки Treg или Th17 [19], так и первичной дифференцировки наивных CD4⁺-Т-клеток, также присутствующих в культуре, однако, учитывая показанное выше мелатонин-зависимое снижение уровня CD4⁺FOXP3⁺-Т-клеток, речь идёт, по-видимому, о первом варианте, т.е. о приобретении регуляторными Т-клетками маркёров и свойств провоспалительной субпопуляции Th17.

Способность субпопуляции клеток Treg дифференцироваться в IL-17-продуцирующие клетки in vitro продемонстрирована и ранее в работе H.J.P.M. Koenen с соавт. [13]: она существенно усиливалась в условиях провоспалительного окружения и была ассоциирована с эпигенетической модификацией, в частности с деацетилированием в FOXP3-домене. Наряду с этим CD4⁺IL-17⁺FOXP3⁺-Т-лимфоциты были выявлены in vivo, причём заметное повышение содержания данной субпопуляции было отмечено у пациентов с органоспецифичными аутоиммунными патологиями, такими как склеродермия [20] и псориаз [21]. Приведённые выше данные свидетельствуют о том, что мелатонин в фармакологических концентрациях может вносить вклад в этот процесс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённое исследование позволяет сделать следующие выводы:

1. мелатонин в концентрации, соответствующей его уровню в периферической крови при фармакологическом использовании, способен стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов, одновременно несущих маркёры Т-хелперных субпопуляций Th17 и Treg;
2. эффекты гормона в отношении классических субпопуляций Th17 и Treg, как правило, однонаправленны, но различны по интенсивности воздействия, что в итоге приводит к сдвигу баланса в направлении клеток Th17;
3. в реализации выявленных эффектов мелатонина частично задействованы мембранные рецепторы МТ1/МТ2.

Выявленные эффекты мелатонина в отношении как классических субпопуляций Th17 и Treg, так и клеток, одновременно синтезирующих ключевые маркёры Т-хелперных субпопуляций Th17 и Treg, указывают на способность гормона сдвигать баланс в направлении провоспалительной субпопуляции клеток Th17, что может вносить вклад в развитие воспаления при различных патологических ситуациях.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда и Пермского края в рамках научного проекта № 22-25-20121.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

About the authors

Еlena М. Kuklina

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: ibis_07@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2173-2724
SPIN-code: 7871-8575

Dr. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Perm

Natalya S. Glebezdina

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: glebezdina_n@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9891-0509
SPIN-code: 3985-4887

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Perm

Irina V. Nekrasova

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: nirina5@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6706-5912
SPIN-code: 8706-1904

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Perm

References

Supplementary files