Роль мелатонина в формировании Т-хелперных субпопуляций, одновременно синтезирующих маркёры Th17 и Treg
- Авторы: Куклина Е.М.1, Глебездина Н.С.1, Некрасова И.В.1
-
Учреждения:
- Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН — филиал Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН
- Выпуск: Том 17, № 4 (2022)
- Страницы: 125-132
- Раздел: Оригинальные исследования
- URL: https://genescells.ru/2313-1829/article/view/375314
- DOI: https://doi.org/10.23868/gc375314
- ID: 375314
Цитировать
Полный текст
Доступ предоставлен
Доступ платный или только для подписчиков
Аннотация
Обоснование. Один из основных гормонов эпифиза мелатонин обладает мультифункциональной активностью, в том числе способностью эффективно регулировать клетки иммунной системы. Под непосредственным контролем гормона находятся субпопуляции Th17 — T-хелперов, продуцирующих интерлейкин-17, и Treg — регуляторных Т-клеток. В настоящее время установлено, что обе субпопуляции неоднородны и обладают высокой пластичностью, и именно неклассические варианты клеток Th17 и Treg играют ведущую роль в патогенезе различных заболеваний.
Цель исследования — оценить эффекты экзогенного мелатонина в отношении классических субпопуляций Th17 и Treg, а также неклассической популяции клеток, одновременно синтезирующей маркёры Т-хелперных субпопуляций Th17 и Treg.
Методы. Объектами исследования служили лейкоциты здоровых доноров. Дифференцировку клеток Th17 и Treg оценивали in vitro проточной цитометрией в ответ на поликлональную активацию (анти-CD3/CD28) — по наличию и уровню соответствующих маркёров. Вклад конкретных рецепторов в мелатонин-зависимую регуляцию клеток Treg и Th17 определяли ингибиторным анализом.
Результаты. Показано, что гормон в концентрации, соответствующей его уровню в периферической крови при фармакологическом использовании, способен не только регулировать формирование классических популяций Th17 и Treg, подавляя дифференцировку CD4+FOXP3+-Т-клеток, но и индуцировать образование Т-лимфоцитов, одновременно несущих маркёры клеток Th17 и Treg.
Заключение. Эффекты мелатонина в отношении и классических популяций Th17 и Treg, и неклассической популяции приводят к сдвигу баланса в направлении клеток Th17, что может вносить вклад в развитие воспаления при различных патологических ситуациях.
Ключевые слова
Полный текст
ВВЕДЕНИЕ
Гормон мелатонин, секретируемый в основном шишковидной железой, обладает широким спектром функций, в том числе способностью эффективно регулировать активность клеток иммунной системы [1–3]. Важными мишенями действия мелатонина в иммунной системе являются Т-лимфоциты, продуцирующие IL-17, — Th17, и регуляторные Т-клетки — Treg: обе субпопуляции имеют рецепторы для мелатонина — как мембранные (МТ1/МТ2), так и внутриклеточный (RORα) — и находятся под непосредственным контролем гормона [4, 5]. Клетки Th17 играют важную роль в защите организма от экстраклеточных патогенов, в развитии воспаления, в том числе аутоиммунного, а клетки Treg, выполняя реципрокные функции, участвуют в предупреждении развития аутоиммунных, аллергических процессов и реакций отторжения трансплантата [6–10]. Однако данные субпопуляции крайне неоднородны и обладают высокой пластичностью. Так, дифференцированные Th17 способны трансформироваться в IFNγ+Th17+-клетки, так называемые Th17/Th1-клетки [11], или в Treg [12], тогда как регуляторные Т-лимфоциты при поляризующих условиях трансдифференцируются в IL-17-продуцирующие клетки [13, 14]. Механизмы пластичности наивных и зрелых клеточных популяций в полной мере не изучены, но этот процесс очень важен, поскольку именно неклассическим популяциям Th17 и Treg отводят в настоящее время ведущую роль в патогенезе различных заболеваний.
Цель исследования — оценка роли мелатонина в формировании Т-хелперных субпопуляций, одновременно синтезирующих маркёры Th17 и Treg.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использовали лейкоциты здоровых небеременных женщин (n=10, средний возраст — 38,30±1,95 года). От всех доноров получали добровольное информированное согласие на участие в исследовании, которое было одобрено Комитетом по этике Института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН — филиала Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН (протокол № 15 от 20 мая 2022 г.) и проведено в соответствии с положениями Хельсинкской декларации (2013) об исследованиях с участием человека.
Лейкоциты выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла–верографина (1,077 г/см3; Pharmacia, Швеция). Из фракции мононуклеарных клеток получали Treg-обогащённую суспензию (CD4+CD25+-Т-лимфоциты) методом иммуномагнитной сепарации (R&D Systems, США). Фракционированные Т-клетки (1×106 кл./мл) культивировали в течение 48 ч в среде RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Serva, Германия), 1 мМ HEPES (Sigma-Aldrich, США), 2 мМ L-глутамина (Serva, Германия) и 40 ед./мл гентамицина (Pharmacia, Швеция) при 37 °С и 5% СО2 в двух вариантах: без активатора (спонтанный вариант) и в условиях поликлональной активации (система для активации на основе моноклональных антител к CD3/CD28; Invitrogen, США).
Синтез клетками транскрипционных факторов RORγt (маркёра дифференцировки Th17) и FOXP3 (маркёра Treg), а также внутриклеточного IL-17 определяли через 48 ч культивирования проточной цитометрией (CytoFLEX S; Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител: анти-CD4-FITC, анти-RORγt-PerCP, анти-FOXP3-PE и анти-IL-17/IL-17A-PerCP (Biolegend, Novus Biologicals, R&D Systems, США). Оценивали как количество Т-клеток, несущих данные маркёры, так и среднюю интенсивность свечения в условных единицах (mean fluorescence intensity, MFI), отражающую уровень конкретного маркёра в клетках.
Мелатонин (Sigma-Aldrich, США) вносили в культуру Т-клеток за 30 мин до активации в концентрациях, соответствующих фармакологическим уровням гормона в крови — 0,5 и 5 нг/мл [15]. Вклад мембранных мелатониновых рецепторов в реализацию эффектов гормона определяли с использованием соответствующих антагонистов — неселективного (лузиндол — для МТ1/МТ2) и селективного (4-P-PDOT – для МТ2) [16]. Их вносили в интактную и стимулированную (CD3/CD28) культуру Т-клеток за 1 ч до активации.
Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флуоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли: Mouse IgG2B-PerCP и Mouse IgG2B-PE (R&D Systems, США). Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином после 48 ч культивирования, составляла 95–98%.
Статистический анализ выполняли с применением парного t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование in vitro показало снижение содержания классических клеток Treg (CD4+FOXP3+-Т-клеток) в культуре интактных лимфоцитов в присутствии мелатонина (табл. 1), хотя в условиях поликлональной активации эффект гормона не выявлен. При этом блокада мембранных рецепторов для мелатонина отменяла супрессивный эффект гормона в отношении классической субпопуляции клеток Treg (количество CD4+FOXP3+-Т-клеток, спонтанный вариант: 4,510±0,847% на фоне лузиндола, 3,810±0,648% на фоне лузиндола и 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05; 4,85±1,05% на фоне 4-P-PDOT; 4,350±0,753% на фоне 4-P-PDOT и 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05). В отношении классической субпопуляции клеток Th17 (CD4+RORγt+-Т-клеток) статистически значимого действия мелатонина не обнаружено (см. табл. 1), хотя также имелась тенденция к снижению. Тем не менее баланс CD4+RORγt+/CD4+FOXP3+-Т-клеток в присутствии гормона сдвигался в направлении клеток Th17 (см. табл. 1). Этот эффект был подтверждён и ростом соотношения уровня соответствующих транскрипционных факторов в клетке, который оценивали по средней интенсивности свечения (MFI RORγt/MFI FOXP3, спонтанный вариант: 0,615±0,103 у.е. — контроль, 1,010±0,260 у.е. — на фоне 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05; 1,070±0,202 — на фоне 5,0 нг/мл мелатонина, р <0,05).
Таблица 1. Влияние мелатонина на дифференцировку клеток Th17 и Treg in vitro
Экспериментальные условия | Контроль | Концентрация мелатонина в культуре | ||
0,5 нг/мл | 5,0 нг/мл | |||
Количество CD4+RORγ | Спонтанный вариант | 1,990±0,388 | 1,520±0,378 | 1,390±0,245 |
Анти-CD3/CD28 | 13,70±3,82 | 12,80±2,72 | 14,20±3,72 | |
Количество CD4+FOXP3+- Т-клеток, % | Спонтанный вариант | 6,260±0,871 | 3,380±0,725* | 4,470±0,926 |
Анти-CD3/CD28 | 26,60±5,31 | 23,90±3,46 | 27,20±5,41 | |
Количество CD4+RORγ | Спонтанный вариант | 0,538±0,084 | 2,240±0,647* | 1,350±0,482 |
Анти-CD3/CD28 | 8,92±3,34 | 7,96±1,68 | 9,39±2,55 | |
Соотношение CD4+RORγ | Спонтанный вариант | 0,334±0,054 | 0,589±0,150** | 0,516±0,142 |
Анти-CD3/CD28 | 0,596±0,116 | 0,679±0,170 | 0,685±0,184 |
* р <0,05 при сопоставлении с контролем; **р=0,05 при сопоставлении с контролем.
Более детальный анализ показал, что на уровне конкретного донора эффекты мелатонина в отношении CD4+RORγt+- и CD4+FOXP3+-Т-клеток, как правило, однонаправленные, разница только в интенсивности воздействия: ингибирующее действие было выше в отношении FOXP3, а стимулирующее — для RORγt (рис. 1). По-видимому, мелатонин в данном случае регулирует ранние этапы дифференцировки клеток Th17 и Treg, общие для обеих субпопуляций [17]. В итоге преимущественное развитие получают клетки Th17. Эти результаты согласуются с полученными нами ранее данными для нефракционированной культуры интактных CD4+-Т-лимфоцитов [5, 18].
Рис. 1. Эффекты мелатонина в отношении дифференцировки клеток Th17 и Treg.
Важно отметить, что в культуре интактных Т-лимфоцитов мелатонин в фармакологической концентрации 0,5 нг/мл существенно увеличивал количество CD4+-T-клеток, одновременно синтезирующих маркёры как Treg (FOXP3), так и Th17 (RORγt) (см. табл. 1, рис. 2).
Рис. 2. Роль мелатонина в дифференцировке Т-лимфоцитов, одновременно несущих маркёры клеток Th17 и Treg.
Более того, соотношение уровней транскрипционных факторов RORγt/FOXP3, оцениваемых по средней интенсивности свечения, в таких клетках было повышено в присутствии гормона (MFI RORγt/MFI FOXP3 в CD4+RORγt+FOXP3+-Т-клетках, спонтанный вариант: 0,514±0,078 у.е. — контроль, 1,260±0,339 у.е. — на фоне 0,5 нг/мл мелатонина, р <0,05; 0,463±0,062 у.е. — на фоне 5,0 нг/мл мелатонина, р >0,05). Данный эффект подтверждался также присутствием в соответствующих пробах IL-17-продуцирующих лимфоцитов, несущих маркёр регуляторных клеток FOXP3, и тенденцией к повышению количества этих клеток на фоне мелатонина (количество CD4+IL-17+FOXP3+-Т-клеток, спонтанный вариант, n=4: 0,723±0,161% — контроль, 3,240±0,941% — на фоне 0,5 нг/мл мелатонина, р >0,05; 1,670±0,441% — на фоне 5,0 нг/мл мелатонина, р >0,05). Строго говоря, такая неклассическая субпопуляция может быть результатом как редифференцировки Treg или Th17 [19], так и первичной дифференцировки наивных CD4+-Т-клеток, также присутствующих в культуре, однако, учитывая показанное выше мелатонин-зависимое снижение уровня CD4+FOXP3+-Т-клеток, речь идёт, по-видимому, о первом варианте, т.е. о приобретении регуляторными Т-клетками маркёров и свойств провоспалительной субпопуляции Th17.
Способность субпопуляции клеток Treg дифференцироваться в IL-17-продуцирующие клетки in vitro продемонстрирована и ранее в работе H.J.P.M. Koenen с соавт. [13]: она существенно усиливалась в условиях провоспалительного окружения и была ассоциирована с эпигенетической модификацией, в частности с деацетилированием в FOXP3-домене. Наряду с этим CD4+IL-17+FOXP3+-Т-лимфоциты были выявлены in vivo, причём заметное повышение содержания данной субпопуляции было отмечено у пациентов с органоспецифичными аутоиммунными патологиями, такими как склеродермия [20] и псориаз [21]. Приведённые выше данные свидетельствуют о том, что мелатонин в фармакологических концентрациях может вносить вклад в этот процесс.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведённое исследование позволяет сделать следующие выводы:
- мелатонин в концентрации, соответствующей его уровню в периферической крови при фармакологическом использовании, способен стимулировать дифференцировку Т-лимфоцитов, одновременно несущих маркёры Т-хелперных субпопуляций Th17 и Treg;
- эффекты гормона в отношении классических субпопуляций Th17 и Treg, как правило, однонаправленны, но различны по интенсивности воздействия, что в итоге приводит к сдвигу баланса в направлении клеток Th17;
- в реализации выявленных эффектов мелатонина частично задействованы мембранные рецепторы МТ1/МТ2.
Выявленные эффекты мелатонина в отношении как классических субпопуляций Th17 и Treg, так и клеток, одновременно синтезирующих ключевые маркёры Т-хелперных субпопуляций Th17 и Treg, указывают на способность гормона сдвигать баланс в направлении провоспалительной субпопуляции клеток Th17, что может вносить вклад в развитие воспаления при различных патологических ситуациях.
ДОПОЛНИТЕЛЬНО
Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда и Пермского края в рамках научного проекта № 22-25-20121.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).
Об авторах
Елена Михайловна Куклина
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН — филиал Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН
Email: ibis_07@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2173-2724
SPIN-код: 7871-8575
д.б.н.
Россия, ПермьНаталья Сергеевна Глебездина
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН — филиал Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН
Автор, ответственный за переписку.
Email: glebezdina_n@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9891-0509
SPIN-код: 3985-4887
к.б.н.
Россия, ПермьИрина Валерьевна Некрасова
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН — филиал Пермского федерального исследовательского центра Уральского отделения РАН
Email: nirina5@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6706-5912
SPIN-код: 8706-1904
к.б.н.
Россия, ПермьСписок литературы
- Drazen D.L., Klein S.L., Yellon S.M., Nelson R.J. In vitro melatonin treatment enhances splenocyte proliferation in prairie voles // J Pineal Res. 2000. Vol. 28, N 1. P. 34–40. doi: 10.1034/j.1600-079x.2000.280105.x
- Arias J., Melean E., Valero N., et al. Efecto de la melatonina sobre la proliferación linfocitaria y la producción de interleucina-2 (IL-2) e interleucina-1 beta (IL-1 beta) en esplenocitos de ratón // Investigación clínica. 2003. Vol. 44, N 1. P. 41–50. (In Spain).
- Espino J., Rodríguez A.B., Pariente J.A. The inhibition of TNF-α-induced leucocyte apoptosis by melatonin involves membrane receptor MT1/MT2 interaction // J Pineal Res. 2013. Vol. 54, N 4. P. 442–452. doi: 10.1111/jpi.12042
- Kuklina E.M. Melatonin as potential inducer of Th17 cell differentiation // Med Hypotheses. 2014. Vol. 83, N 3. P. 404–406. doi: 10.1016/j.mehy.2014.07.006
- Куклина Е.М., Глебездина Н.С., Некрасова И.В. Роль мелатонина в контроле дифференцировки Т-лимфоцитов, продуцирующих интерлейкин-17 (Th17) // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015. Т. 160, № 11. С. 604–607.
- Bedoya S.K., Lam B., Lau K., et al. Th17 cells in immunity and autoimmunity // Clin Dev Immunol. 2013. Vol. 2013. P. 986789. doi: 10.1155/2013/986789
- Jadidi-Niaragh F., Mirshafiey A. Th17 cell, the new player of neuroinflammatory process in multiple sclerosis // Scand J Immunol. 2011. Vol. 74, N 1. P. 1–13. doi: 10.1111/j.1365-3083.2011.02536.x
- Kanamori M., Nakatsukasa H., Okada M., et al. Induced regulatory T cells: their development, stability, and applications // Trends Immunol. 2016. Vol. 37, N 11. P. 803–811. doi: 10.1016/j.it.2016.08.012
- Jeffery H.C., Braitch M.K., Brown S., Oo Y.H. Clinical potential of regulatory T cell therapy in liver diseases: an overview and current perspectives // Front Immunol. 2016. Vol. 7. P. 334. doi: 10.3389/fimmu.2016.00334
- Shevyrev D., Tereshchenko V. Treg heterogeneity, function, and homeostasis // Front Immunol. 2020. Vol. 10. P. 3100. doi: 10.3389/fimmu.2019.03100
- Cosmi L., Liotta F., Maggi E., et al. Th17 cells: new players in asthma pathogenesis // Allergy. 2011. Vol. 66, N 8. P. 989–998. doi: 10.1111/j.1398-9995.2011.02576.x
- Gagliani N., Amezcua Vesely M.C., Iseppon A., et al. Th17 cells transdifferentiate into regulatory T cells during resolution of inflammation // Nature. 2015. Vol. 523, N 7559. P. 221–225. doi: 10.1038/nature14452
- Koenen H.J.P.M., Smeets R.L., Vink P.M., et al. Human CD25highFoxp3pos regulatory T cells differentiate into IL-17–producing cells // Blood. 2008. Vol. 112, N 6. P. 2340–2352. doi: 10.1182/blood-2008-01-133967
- Komatsu N., Okamoto K., Sawa S., et al. Pathogenic conversion of Foxp3+ T cells into TH17 cells in autoimmune arthritis // Nat Med. 2014. Vol. 20, N 1. P. 62–68. doi: 10.1038/nm.3432
- Gooneratne N.S., Edwards A.Y.Z., Zhou C., et al. Melatonin pharmacokinetics following two different oral surge-sustained release doses in older adults // J Pineal Res. 2012. Vol. 52, N 4. P. 437–445. doi: 10.1111/j.1600-079X.2011.00958.x
- Cecon E., Oishi A., Jockers R. Melatonin receptors: molecular pharmacology and signalling in the context of system bias // Br J Pharmacol. 2018. Vol. 175, N 16. P. 3263–3280. doi: 10.1111/bph.13950
- Prado D.S., Cattley R.T., Shipman C.W., et al. Synergistic and additive interactions between receptor signaling networks drive the regulatory T cell versus T helper 17 cell fate choice // J Biol Chem. 2021. Vol. 297, N 6. P. 101330. doi: 10.1016/j.jbc.2021.101330
- Глебездина Н.С., Олина А.А., Некрасова И.В., Куклина Е.М. Молекулярные механизмы контроля дифференцировки регуляторных т-лимфоцитов экзогенным мелатонином // Доклады Академии наук. 2019. Т. 484, № 2. С. 224–227. doi: 10.31857/S0869-56524842224-227
- Yazdani M.R., Khosropanah S., Doroudchi M. Interleukin-17 production by CD4+CD45RO+Foxp3+ T cells in peripheral blood of patients with atherosclerosis // Arch Med Sci Atheroscler Dis. 2019. Vol. 4. P. 215–224. doi: 10.5114/amsad.2019.87525
- Liu X., Gao N., Li M., et al. Elevated levels of CD4+CD25+FoxP3+ T cells in systemic sclerosis patients contribute to the secretion of IL-17 and immunosuppression dysfunction // PloS One. 2013. Vol. 8, N 6. P. e64531. doi: 10.1371/journal.pone.0064531
- Bovenschen H.J., van de Kerkhof P.C., van Erp P.E., et al. Foxp3+ regulatory T cells of psoriasis patients easily differentiate into IL-17A-producing cells and are found in lesional skin // J Invest Dermatol. 2011. Vol. 131, N 9. P. 1853–1860. doi: 10.1038/jid.2011.139