Neutrophil extracellular traps: structure and biological role

Olga E. Mirgorodskaya; Одинцова Ирина Алексеевна; Olga E. Mirgorodskaya; Миргородская Ольга Евгеньевна; Svetlana E. Rusakova; Русакова Светлана Эдуардовна; Alena V. Gorbulich; Горбулич Алена Валентиновна; Valery G. Gololobov; Гололобов Валерий Григорьевич

doi:10.23868/gc352562

Neutrophil extracellular traps: structure and biological role

Authors: Mirgorodskaya O.E.¹, Mirgorodskaya O.E.¹, Rusakova S.E.¹, Gorbulich A.V.¹, Gololobov V.G.¹
Affiliations:
1. S.M. Kirov Military Medical Academy
Issue: Vol 17, No 4 (2022)
Pages: 63-74
Section: Reviews
URL: https://genescells.ru/2313-1829/article/view/352562
DOI: https://doi.org/10.23868/gc352562
ID: 352562

Cite item

Full Text

Open Access
Restricted Access

Access granted
Restricted Access

Subscription or Fee Access

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Neutrophilic granulocytes make up the majority of blood leukocytes and realize their functions in tissues. Highly differentiated cells of neutrophilic granulocytic differon are characterized by the ability to form neutrophilic extracellular traps (NEТs) — network-like structures formed mainly from the intracellular components of the neutrophil. NEТs are an important factor in the body's defense against infectious pathogens, aimed at the destruction of viruses, bacteria, fungi and protozoa. Analyzed the composition of NEТs, methods of detection, mechanisms and main stages of their formation: 1) the effect of the inductor on the neutrophilic granulocyte and the activation of the respiratory burst with the release of reactive oxygen species (oxygen superoxide); 2) loss of the characteristic segmentation of the nucleus, decondensation of chromatin; 3) the disintegration of the karyolemma into many small vesicles, the movement of chromatin strands (DNA with histone proteins) into the cytoplasm; 4) the formation of NEТs due to the connection of chromatin with numerous biologically active substances of the cytoplasm (mainly from lysed granules); 5) destruction of the plasmolemma and the release of NEТs into the intercellular environment. Data on the participation of NEТs in protective reactions and pathological processes are presented.

Keywords

neutrophil granulocytes, neutrophil extracellular traps, leukocytes, netosis, phagocytosis, degranulation

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Нейтрофилы принадлежат к клеткам, участвующим в реакциях врождённого иммунитета [1–4]. После трансэндотелиальной миграции нейтрофильные гранулоциты приобретают повышенную метаболическую и фагоцитарную активность, полностью сохраняя потенциал бактерицидных факторов [5]. Дегрануляция нейтрофилов характерна для многих процессов, в том числе для формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ, NETs — neutrophil extracellular traps), представляющих нефагоцитарный тип тканевой резистентности, при котором количество инактивированных нейтрофилом бактерий существенно превышает аналогичный показатель при фагоцитозе [6–8].

СТРУКТУРА НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК

Нейтрофильные внеклеточные ловушки — это высокоактивные сетевидные субстанции, находящиеся за пределами нейтрофильного гранулоцита, но сформированные преимущественно из его внутриклеточных компонентов [7–11]. Основу НВЛ составляет хроматин, образованный нитями ядерной ДНК в комплексе с белками-гистонами H2A, H2B, H3, H4 [12]. В составе НВЛ обнаружены и такие эффекторные вещества, как бактерицидные ферменты, лактоферрин, активированный протеин С, эластаза, металлопротеиназа, дефензины 1 и 3, миелопероксидаза, антибактериальные катионные белки, нейтральные сериновые протеазы, S100 кальций-связывающих белков — А8, А9, А12 и др. [13–15]. Нейтрофильной эластазе отводится ведущая функция в формировании НВЛ: так, мыши, дефицитные по этому ферменту, образовывать их не могут [16].

В составе НВЛ выявлено более 40 веществ белковой природы, которые представляют собой белки цитоскелета (актин, α-актинин, миозин, цитокератин 10, пластин 2), миелоидный ядерный дифференцировочный антиген, но большинство — это содержимое всех типов секреторных гранул нейтрофила [8, 17, 18]. Биологически активные компоненты в цитоплазме связываются с ДНК и, выходя за пределы клетки, формируют НВЛ, которые на препаратах обычно выглядят как «облакообразные структуры» [16, 19–21]. Размер НВЛ колеблется в диапазоне от 25 до 50 мкм, а диаметр нитей ДНК в их составе равен 15–17 нм [22]. Следует отметить, что адгезия некоторых белков к компонентам НВЛ может происходить и за пределами нейтрофильного гранулоцита [23].

МЕХАНИЗМ ФОРМИРОВАНИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК

Способностью образовывать НВЛ обладают активированные (инициированные, стимулированные) нейтрофилы. Факторы, вызывающие активацию так называемых внутриклеточных киллинговых систем нейтрофильного гранулоцита, чрезвычайно разнообразны: многочисленные бактерии (Salmonella enterica, St. aureus, E. coli и др.), грибы (Candida albicans и др.), простейшие (Plasmodium falciparum) [24–27]. Образование НВЛ стимулируется также провоспалительными веществами (интерлейкин-8, перекись водорода, липополисахариды, форбол-миристат-ацетат). Представляют интерес сведения о том, что способностью индуцировать образование НВЛ при эндотоксемии обладают тромбоциты, активированные липополисахаридами [28]. Мнения исследователей об антивирусной способности НВЛ расходятся, но ряд публикаций последнего времени свидетельствует, что, например, вирус SARS-CoV2 активирует образование нейтрофильных ловушек [29–31].

Образование НВЛ обеспечивается рецепторным аппаратом, причём для достижения оптимального антимикробного, антипаразитарного и фунгицидного эффекта требуется воздействие стимула не на один, а на несколько клеточных рецепторов одновременно [32]. В настоящее время рассматриваются два механизма формирования НВЛ: более детально изученный NOX-зависимый (NADPH-оксидаза-зависимый) и менее изученный NOX-независимый [20, 23, 33, 34]. Нетоз, индуцированный кальциевыми ионофорами и часто называемый «NADPH-оксидаза-независимым», правильнее именовать «митохондриально-зависимым нетозом» [35].

Образование активных форм кислорода стимулирует NOX-зависимый механизм, он же способствует дезинтеграции компонентов клеточных мембран, выходу деконденсированной ДНК с адгезированными белками в межклеточную среду. Активация NADPH-оксидазной системы является обязательным, но недостаточным условием формирования НВЛ [36]. В начальной стадии их образования происходит так называемый респираторный взрыв, приводящий к образованию супероксидного аниона [37]. Ядерные белки (гистоны) подвергаются специфическим модификациям, задерживающим активацию генов, что приводит к ослаблению взаимодействия гистонов с ДНК и деконденсации хроматина [11, 38].

В результате активации нейтрофильных гранулоцитов возможны два варианта образования НВЛ — везикулярный и литический, которые принципиально отличаются друг от друга [39]. Везикулярный механизм является кислороднезависимым и начинается в первые минуты после активации нейтрофильного гранулоцита бактериями с мощными антиоксидазными свойствами. При этом происходит неравномерное расширение перинуклеарного пространства нейтрофила, его постепенное заполнение ДНК с последующим формированием везикул, имеющих вид мелких бусинок, которые перемещаются в межклеточное пространство. При этом плазмолемма не разрушается [40]. Существует мнение, что при везикулярном механизме формирования НВЛ клетка сохраняет свою жизнеспособность [40]. Остаётся открытым вопрос о том, может ли быть жизнеспособным нейтрофил, утративший ДНК. Отвечая на закономерный вопрос: каким образом клетка сохраняет жизнеспособность, лишившись ДНК, сторонники этой концепции приводят в пример эритроциты и кровяные пластинки. По нашему мнению, такая аналогия не вполне корректна, необходимо продолжать изучение этого феномена с целью поиска более убедительных доказательств жизнеспособности гранулоцита после выделения НВЛ.

При стимуляции нейтрофила может запускаться литический механизм образования НВЛ. Его основные признаки: лизис кариолеммы, смешение хроматина с биологически активными веществами цитоплазмы, лизис плазмолеммы и поступление НВЛ в межклеточное пространство в виде высокоактивной биосубстанции. При этом клетка погибает. Именно такая кислородзависимая форма клеточной гибели и получила название нетоза (NETosis) [33, 41].

Основываясь на анализе научных публикаций, выделим основные стадии образования НВЛ: 1) воздействие индуктора на нейтрофильный гранулоцит и активация «респираторного взрыва» с выделением активных форм кислорода (супероксид кислорода); 2) утрата характерной сегментации ядра, деконденсация хроматина; 3) распад кариолеммы на множество мелких пузырьков (везикул), перемещение нитей хроматина (ДНК с белками-гистонами) в цитоплазму; 4) образование НВЛ вследствие соединения хроматина с многочисленными биологически активными веществами цитоплазмы (преимущественно из лизированных гранул); 5) разрушение плазмолеммы и выход НВЛ в межклеточную среду [17, 41]. По данным разных авторов, время формирования НВЛ колеблется в диапазоне от 10 мин до 4 ч, что в значительной мере зависит от активирующего нейтрофил агента, а также от возраста пациента. У новорождённых образование НВЛ выражено слабее, чем у взрослых [16]. В среднем через час после стимуляции нейтрофил утрачивает сегментацию ядра, хроматин деконденсируется; через 2 ч кариолемма образует везикулы, хроматин поступает в цитоплазму, а мембрана гранул нейтрофилов лизируется. Через 3 ч гранулы в цитоплазме практически не выявляются, а их содержимое находится в цитоплазме [22].

Считается, что нейтрофильные гранулоциты цельной крови и её лейкоцитарной взвеси в норме не образуют НВЛ, и в крови здоровых людей их не должно быть [6]. Для образования НВЛ необходимо прикрепление нейтрофила к субстрату, так как в суспензии они формируются гораздо менее активно [16]. Образование НВЛ не является случайным или спонтанным процессом — существуют сложные молекулярные механизмы его контроля и регулирования [40, 42–44]. После разрушения НВЛ при участии ДНКазы-I оставшийся дебрис лизируется макрофагами [45].

НЕТОЗ КАК ФОРМА НЕОБРАТИМЫХ РЕАКТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ

Наиболее характерными формами гибели нейтрофильных гранулоцитов многие годы считали апоптоз и некроз. После первых публикаций о НВЛ было введено понятие «нетоз» [24, 33, 39]. Несколько позже такая форма гибели была обнаружена у тучных клеток, эозинофильных гранулоцитов, макрофагов [46–48], моноцитов [49] и лимфоцитов [50]. Так как выброс ДНК во внеклеточное пространство осуществляется не только нейтрофилами, но и другими видами клеток, этот механизм получил более широкое название — этоз (от англ. extracellular traps — ETs).

В обзорной статье Р.В. Деева и соавт. [51], посвящённой современным представлениям о клеточной гибели, представлена подробная характеристика нетоза. Некоторые авторы придерживаются точки зрения о том, что существует так называемый витальный и суицидальный нетоз [40]. Витальный нетоз сопряжён с везикулярным механизмом образования НВЛ, а суицидальный — с литическим. В научном сообществе по этому вопросу возникают сомнения в корректности предложенной терминологии, особенно это касается термина «витальный нетоз».

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК

Анализ научных публикаций свидетельствует, что способы идентификации НВЛ как на гистологических срезах, так и в фиксированной на предметном стекле клеточной взвеси постоянно совершенствуются. НВЛ могут быть идентифицированы с помощью различных видов микроскопии (конфокальная, сканирующая и трансмиссионная электронная). Методы электронной микроскопии позволяют не только обнаружить НВЛ, но и последовательно проследить за процессом их формирования. Применяют также некоторые гистохимические методики для последующей световой микроскопии, проточную флуориметрию, иммунофлуоресцентную микроскопию, ряд биохимических методов [14, 52, 53]. И.И. Долгушиным и соавт. [54] разработаны оригинальные методы выявления НВЛ в периферической крови и слизистых секретах, которые применяют для определения эффективности вакцин и некоторых лекарственных препаратов. Окраска акридиновым оранжевым взвеси нейтрофилов венозной крови человека и последующее изучение препарата с помощью люминесцентного микроскопа и фильтров с определённой длиной световой волны позволили упростить и ускорить выявление НВЛ, а также оценить их количественно [54].

С целью быстрого определения жизнеспособности клеток и визуализации внеклеточной ДНК используют высокочувствительный флуоресцентный краситель SYTOX Green. Для этого метода необходимы проточные цитометры, флуоресцентный микроскоп, флуорометр или считыватели флуоресцентных микропланшетов [19, 55]. Поскольку при связывании нуклеиновых кислот флуоресценция увеличивается в 500 раз, кратковременная инкубация утративших жизнеспособность клеток с SYTOX Green приводит к яркой зелёной флуоресценции с пиком излучения 523 нм при возбуждении 488 нм аргон-ионным лазером или любым другим (в диапазоне 450–490 нм). Для нейтрофилов чистой фракции информативна окраска не только SYTOX Green, но и акридиновым зелёным, по Романовскому–Гимзе. Достаточно информативными методами визуализации также являются следующие: одновременное использование двух красителей: SYTOX Green (для окраски внеклеточной ДНК и погибших ядер) и синьки Эванса (для фонового окрашивания живых клеток) [54]; окраска акридиновым оранжевым и затем по Романовскому–Гимзе [56].

Представляет интерес работа K. Shiogama с соавт. [57], в которой отражены результаты анализа парафиновых тканевых срезов при формалиновой фиксации материала с выраженной нейтрофильной инфильтрацией. Многочисленные НВЛ и фибриновая сеть вокруг них визуализировались с помощью иммуногистохимического метода выявления лактоферрина и фибриногенной γ-цепи. Связанные с нейтрофилом вещества (лактоферрин, цитруллинированный гистон H3, миелопероксидаза и нейтрофильная эластаза) исследователи расценивали как маркёры НВЛ, а фибриногенную γ-цепь использовали в качестве фибринового маркёра. Нейтрофилы находились внутри своеобразной паутины, состоящей из волокон разной толщины и компактизации: тонких, толстых и так называемых сгруппированныx толстыx. Показано, что лактоферрин представляет собой стабильный маркёр НВЛ, тонкие фибриллы принадлежат НВЛ; толстые фибриллы состоят либо только из фибрина, либо из смешения фибрина и «ловушечных нитей», а сгруппированные («упакованные») толстые фибриллы состоят исключительно из фибрина. Такой приём позволяет дифференцировать входящие и не входящие в состав НВЛ фибриллярные компоненты.

В целом, оценивая лабораторные методы выявления НВЛ, следует отметить, что они являются финансово затратными, так как для большинства требуется специальная аппаратура и дорогостоящие реактивы.

УЧАСТИЕ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК В ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЯХ И ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ

Формирование НВЛ — важный фактор защиты организма от инфекционных патогенов, уничтожения вирусов и бактерий [58–62]. НВЛ ограничивают повреждение тканей, задерживая и разрушая патологические агенты. В литературе имеются многочисленные сведения о том, что образование НВЛ играет важную роль в патогенезе инфекционных и неинфекционных заболеваний [18, 37, 63–66]. Встречаются сообщения о формировании НВЛ при таких заболеваниях, как бактериальный вагиноз, острый аппендицит, малярия, бронхолёгочный аспергиллёз, пневмония, диабет 2-го типа, атеросклероз и др. [31, 40, 67]. НВЛ обнаружены при сердечно-сосудистых заболеваниях, участвуют в патогенезе заболеваний роговицы и многих других патологических состояниий [68–72]. Пародонтит — одна из разновидностей локальной иммуновоспалительной патологии, в патогенезе которой немаловажную роль играют НВЛ [31]. Учёные фокусируют внимание на важности НВЛ как прогностического маркёра у тяжелобольных пациентов и на необходимости уточнения их патофизиологии [73–75]. При изучении SIV-инфекции (экспериментальная модель у обезьян, аналог ВИЧ) у животных R. Sivanandham с соавт. [76] обнаружили НВЛ в кишечнике, лёгких и печени, а также в кровеносных сосудах почек и сердца. Авторы указывают, что НВЛ способствуют снижению количества иммунокомпетентных клеток, характерному для ВИЧ/SIV-инфекции. В этой работе представлены также сведения о том, что благодаря «захвату» и агрегации тромбоцитов НВЛ могут усиливать коагулопатию, связанную с ВИЧ/SIV, и способствовать развитию сопутствующих сердечно-сосудистых заболеваний. Сведения о том, что НВЛ замедляют и осложняют процесс заживления ран при диабете [77], требуют, на наш взгляд, дополнительной проверки и уточнения, так как при данной патологии влияние на раневой процесс оказывают многие факторы, и связывать это исключительно с НВЛ вряд ли оправданно.

В ходе эксперимента по изучению карциномы лёгкого у мышей обнаружены опухолевые клетки, «захваченные» НВЛ внутри сосудов микроциркуляторного русла, что позволило авторам констатировать участие нейтрофильных ловушек в противоопухолевой защите [78]. Авторы неоднозначно оценивают этот феномен, называя комплексы «НВЛ + опухолевые клетки» микрометастазами, для разрушения которых предлагают применять вещества-ингибиторы эластазы нейтрофилов или ДНКазу.

В обзорной статье D. Nakazawa и T. Kudo [15] представлены сведения о разнообразии нейтрофилов у пациентов с аутоиммунными заболеваниями и обсуждаются возможные новые терапевтические стратегии. При лечении системной красной волчанки в качестве одного из терапевтических приёмов рассматривают разрушение НВЛ и их отдельных компонентов. Исследования показали, что гетероморфия (разнообразие) нейтрофилов (по фенотипу, функции, особенностям участия в развитии воспалительного процесса) оказывает влияние на характеристики НВЛ [79–82].

В работе H. Yang с соавт. [73] справедливо отмечено, что НВЛ — это «обоюдоострые мечи врождённого иммунитета» и оценивать их роль следует с осторожностью. Во многих публикациях сделан акцент на том, что нетоз при определённых обстоятельствах следует рассматривать и как источник аутоантигенов, способствующий развитию и течению аутоиммунных заболеваний. В публикации H. Shida с соавт. [83] указывается, что чрезмерное образование НВЛ приводит к побочным эффектам, например индукции антинейтрофильных цитоплазматических антител (АНЦА, англ. ANCA). Между НВЛ и ANCA может образоваться «петля обратной связи», которая называется «порочным циклом ANCA–НВЛ» [83]. При нарушении регуляции формирования и удаления НВЛ образуются аутоантитела к ДНК, гистонам и другим белкам нейтрофильных гранулоцитов, но роль НВЛ при аутоиммунных заболеваниях до конца не исследована и требует дальнейшего изучения. Компоненты НВЛ могут служить аутоантигенами, которые продуцируют аутоантитела против ловушек и ускоряют иммунный ответ с помощью интерферона I типа [84, 85]. Более того, цитотоксические НВЛ-компоненты в виде молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением, могут травмировать соседние клетки, усугубляя тяжесть аутоиммунных заболеваний [15, 86]. Известно, что нейтрофильные гранулоциты активно участвуют в заживлении ран, особенно на ранней стадии, но в условиях раневого процесса НВЛ практически не изучены [87]. Они обнаружены при формировании свёртка крови в процессе коагуляции, но их избыточное образование может способствовать чрезмерной коагуляции, что неизбежно приведёт к нарушению кровоснабжения тканей и органов.

Пандемия новой коронавирусной инфекции COVID-19 выявила острую потребность в современных лечебных подходах для борьбы с клиническими проявлениями этого заболевания при тяжёлом течении, включающими наряду с синдромом тяжёлой воспалительной реакции или сепсисом острый респираторный дистресс-синдром, нейтрофилию, «цитокиновый шторм» [29, 30, 88]. Предполагают, что нейтрофильные гранулоциты являются мишенью для иммунопатологических осложнений у тяжелобольных пациентов с COVID-19. Нейтрофильная инфильтрация, высвобождение НВЛ, активация комплемента и тромбоз сосудов при COVID-19 способствуют более высокой смертности у пациентов с сопутствующими заболеваниями [30, 31, 89]. Образование внутрисосудистых НВЛ имеет важное значение для реализации патогенеза тяжёлого течения COVID-19 у пациентов с пародонтитом и характеризуется повышенным уровнем циркулирующих НВЛ и склонностью к увеличению скорости их формирования, что оказывает существенное влияние на врождённый иммунитет и восприимчивость к заражению SARS-CoV-2 [31]. Эндотоксин LPS (липополисахаридный эндотоксин, являющийся термостабильным компонентом наружной части клеточной мембраны всех грамотрицательных бактерий) связывает спайковый белок SARS-CoV-2 и этот комплекс, который более активен, чем несвязанный эндотоксин, и вызывает усиленное образование НВЛ. По мнению L. Vitkov с соавт. [31], НВЛ в сосудистой крови являются общим признаком как COVID-19, так и пародонтита, а также ряда других заболеваний с низкой степенью эндотоксинемии (ожирение, диабет, сердечно-сосудистые заболевания), повышая риск развития тяжёлой формы COVID-19. В этой работе обсуждается роль дефицита ДНКазы-I и слабовыраженной эндотоксинемии в формировании склонности к повышенному образованию НВЛ при пародонтите как отягчающих факторов течения COVID-19.

Таким образом, накопилось достаточно фактов как о позитивном, так и о негативном влиянии НВЛ и нетоза на патофизиологические процессы, происходящие в тканях, органах и организме в целом. Требует уточнения информация, что микроорганизмы, имеющие на поверхности капсулу или нуклеазы, не захватываются ловушками. Не теряет своей актуальности исследование НВЛ при особо опасных инфекциях. Определённые перспективы имеет детальное изучение НВЛ при паразитарных заболеваниях, так как в этом случае объект достаточно велик для фагоцитоза и может (хотя бы частично) быть инактивирован компонентами ловушки. Решение этих вопросов будет способствовать созданию новых эффективных лекарственных препаратов и вакцин с избирательным действием на нейтрофильные гранулоциты и (или) НВЛ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ научных публикаций свидетельствует об интересе специалистов разного профиля — морфологов, микробиологов, биохимиков, патофизиологов, клиницистов — к изучению нейтрофильных внеклеточных ловушек. Благодаря разнообразным методическим приёмам установлены их структурные компоненты, механизмы формирования, получены сведения об участии нейтрофильных внеклеточных ловушек в защитных реакциях и некоторых патологических состояниях. Вместе с тем обзор позволил выявить ряд спорных и малоизученных вопросов, требующих дальнейшей разработки. Среди них — уточнение терминологических понятий (например, «витальный и суицидальный нетоз») и поиск достоверных фактов о степени жизнеспособности нейтрофильного гранулоцита, лишившегося ДНК. Актуальной задачей также является возможное внедрение в клиническую практику новых знаний о нейтрофильных внеклеточных ловушках как структурах с выраженной защитной функцией, участвующих в функционировании не только тканей и органов, но и всего организма в целом. Необходимо продолжать исследования по изучению формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек при различных патологических состояниях, в том числе при травмах различного генеза.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Не указан.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).