Autosomal recessive congenital ichthyosis: diagnosis, modeling and approaches to therapy

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Ихтиозы представляют собой гетерогенную группу болезней, как наследственных, так и приобретённых, и характеризуются наличием сухой, огрубевшей кожи с заметным шелушением; при этом изменённая кожа покрывает большие по площади участки тела. Развитие гиперкератоза связывают со злокачественными новообразованиями, аутоиммунными, метаболическими, эндокринными и инфекционными заболеваниями [1]. Разнообразие фенотипических проявлений ихтиозов приводит к трудностям диагностики и путанице в терминологии в разных странах. В настоящем обзоре используется классификация, принятая на 1-й консенсусной конференции, посвящённой ихтиозам (Сорез, Франция), с добавлением информации о мутациях, связанных с развитием ихтиоза, которые описаны с 2010 года [2].

Термин «аутосомно-рецессивный врождённый ихтиоз» (АРВИ) описывает гетерогенную группу состояний — ихтиозов, которые вызваны мутациями, вновь возникшими в клетках зародышевой линии по крайней мере в десяти генах. Патологические варианты генов ALOX12B, ALOXE3, ихтина (NIPAL4), PNPLA1 и CYP4F22 ассоциированы с развитием небуллёзной врождённой ихтиозиформной эритродермии (НВИЭ; OMIM 242100, OMIM 606545, OMIM 612281, OMIM 615024, OMIM 604777) [3, 4].

Мутации, приводящие к синтезу укороченного продукта гена ABCA12, как правило, вызывают ихтиоз Арлекина (ИА, OMIM 242500), тогда как миссенс-мутации ABCA12 связаны с ламеллярным ихтиозом (ЛИ; OMIM 601277) [5, 6]. Мутации в гене NIPAL4 приводят к развитию АРВИ III типа [7]. Мутации в гене трансглутаминазы-1 (transglutaminase 1, TGM1) приводят к развитию ЛИ и более редкой формы АРВИ — «купального костюма» (OMIM 242300) [8]. Идентифицировано также несколько редких подтипов, таких как самоизлечивающийся коллодиевый ихтиоз (обусловлен мутациями в генах ALOX12B, ALOXE3 и TGM1) [9].

Несмотря на разнообразие мутаций и фенотипических проявлений АРВИ, от 32 до 68% случаев (~70–90% из них — ЛИ) обусловлены мутацией в гене TGM1 [10]. Описано более 115 мутаций в данном гене у пациентов разного расового и этнического происхождения. Самый высокий уровень заболеваемости ЛИ отмечается в Норвегии (1:91 000) и Галиции (север Испании) (1:122 000), что обусловлено эффектом основателя. Предположительно мутация в Галиции могла возникнуть около 1000 лет назад, а затем распространиться на эквадорскую провинцию Манаби, где широко распространён ЛИ [11].

Ген TGM1 расположен в хромосоме 14q11.2 (GenBank NM_000359.3) и кодирует фермент трансглутаминазу-1 (TGase-1) с молекулярной массой ~90 кДа. TGase-1 является Са²⁺-зависимым ферментом, который синтезируется кератиноцитами эпидермиса кожи и клетками многослойного плоского эпителия верхних отделов пищеварительного тракта и нижних отделов женских половых органов (эпителии эктодермального гистогенеза) [12]. TGase-1 катализирует сшивание белков-предшественников Nε-(γ-глутамил)-лизина, таких как лорикрин и инволюкрин. Эти связанные пептиды образуют ороговевшую клеточную оболочку (ОКО) — непроницаемую для воды структуру, важную для барьерной функции кожи. ОКО выполняет функцию каркаса для последующего прикрепления молекул липидов с образованием естественного рогового слоя кожи [13]. Изменение функции TGase-1 приводит к появлению дефектных межклеточных липидных слоев и нарушению барьерной функции рогового слоя [14] (рис. 1). Тяжёлая дисфункция TGase-1 может привести к классическому фенотипу ЛИ [15], частичная потеря активности TGase-1 — к развитию лёгкого ЛИ [16] или фенотипа НВИЭ [17].

 

Рис. 1. Формирование ороговевшей клеточной оболочки в норме и при аутосомно-рецессивном врождённом ихтиозе: TGM1 — трансглутаминаза-1, TGM3 — трансглутаминаза-3; TGM5 — трансглутаминаза-5, ББП — белки, богатые пролином.

 

После мутаций в гене TGM1 наиболее частыми причинами АРВИ являются мутации в генах ALOXE3 и ALOX12B (17–30%), NIPAL4 (10–16%), CYP4F22 (8–10%), ABCA12 (5%). Количество случаев, в которых мутация неизвестна, варьирует от 15 до 22% [18]. Гены, мутации в которых связаны с развитием различных форм АРВИ, обобщены в табл. 1 ([19–26]).

 

Таблица 1. Гены и связанные с ними формы аутосомно-рецессивного врождённого ихтиоза

Ген	Форма аутосомно-рецессивного врождённого ихтиоза	OMIM, #	Источник
ALOX12B	НВИЭ, самоизлечивающийся коллодиевый ихтиоз	242100	[3, 4, 9]
ALOXE3	НВИЭ, самоизлечивающийся коллодиевый ихтиоз	606545	[9, 19]
NIPAL4	НВИЭ	612281	[7, 20]
PNPLA1	НВИЭ	615024	[21]
CYP4F22	НВИЭ	604777	[4]
ABCA12 (мутация, приводящая к синтезу укороченного белкового продукта)	ИА	242500	[5]
ABCA12 (миссенс-мутация)	ЛИ	601277	[6, 22]
TGM1	ЛИ, купальный ихтиоз, самоизлечивающийся коллодиевый ихтиоз	242300	[8, 9]
CERS3	Вариабельный фенотип АРВИ	615023	[23]
SDR9C7	Вариабельный фенотип АРВИ	617574	[24]
SULT2B1	Вариабельный фенотип АРВИ	617571	[25]
LIPN	Вариабельный фенотип АРВИ	613943	[26]

Примечание: НВИЭ — небуллёзная врождённая ихтиозиформная эритродермия, ИА — ихтиоз Арлекина, ЛИ — ламеллярный ихтиоз, АРВИ — аутосомно-рецессивный врождённый ихтиоз.

 

ПАТОФИЗИОЛОГИЯ И ДИАГНОСТИКА АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОГО ВРОЖДЁННОГО ИХТИОЗА

Ихтиоз Арлекина характеризуется наиболее тяжёлыми фенотипическими проявлениями в группе АРВИ. Новорождённые с ИА всегда имеют коллодиевую мембрану и выраженный эктропион и эклабиум. По всему телу у пациентов присутствуют крупные серые или желтоватые чешуйки, также наблюдается сильная эритема. Тяжёлые поражения кожи вызывают нарушение терморегуляции и повышают риск развития кожных суперинфекций. Другим осложнением, возникающим у пациентов как с ИА, так и с другими формами АРВИ, является ангидроз (неспособность к потоотделению) [18]. Развитие ангидроза, вероятно, связано с невидимой гиперкератотической обтурацией протоков потовых желёз [27]. Смертность новорождённых с ИА составляет около 50%, что является наиболее высоким показателем по сравнению с другими типами АРВИ [28].

Постановка генетического диагноза ИА обычно не представляет затруднений из-за его выраженных клинических симптомов. Пренатальное обнаружение мутаций гена ABCA12 — важный диагностический критерий. До идентификации ABCA12 как гена, вызывающего заболевание, пренатальную диагностику ИА проводили с помощью электронной микроскопии образцов биопсии кожи плода. Ультраструктура зернистого слоя эпидермиса пациента с ИА нарушена из-за накопления аномальных ламеллярных гранул [29]. Проведение трёхмерной эхографии у беременной может быть использовано для выявления тяжёлых АРВИ, в том числе ИА, диагностическим признаком при этом будет наличие в амниотической жидкости плотных плавающих частиц («признак снежинки»), что укажет на аномальное отторжение ороговевших кератиноцитов (дисадгезию) [30].

Новорождённые с мутацией в гене TGM1 часто имеют эктропион и коллодиевую мембрану [30]. Впоследствии мембрана высыхает и отслаивается, а затем заменяется коричневыми пластинчатыми чешуйками. Локализация грубых чешуек может быть ограничена туловищем, ногами, предплечьями и лбом при лёгкой форме ЛИ или обнаруживаться по всему телу при тяжёлых его формах [31]. У детей с тяжёлым поражением могут возникать эктропион, эклабиум, рубцовая алопеция волосистой части головы и бровей, ладонный и подошвенный гиперкератоз. Ногти могут быть изогнуты, а уши часто сморщены и плотно прилегают к коже головы. Возможна лёгкая эритродермия [32].

Диагностика ЛИ также основывается на биопсии кожи плода и исследовании с помощью электронной микроскопии на более поздних сроках беременности. Ультраструктурный анализ клеток больных АРВИ показал, что ОКО отсутствует у пациентов с ЛИ, а в кератиноцитах снижен уровень активности TGase-1 [33]. Отсутствие или значительные дефекты ОКО наблюдаются также в эпидермальных чешуйках и ногтях пациентов с мутацией в гене TGM1 [34]. Кроме того, в эпидермисе больных ЛИ были обнаружены холестериновые щели, липидные вакуоли в ороговевших клетках и аномальные ламеллярные гранулы [35]. В зависимости от типа мутации в кератиноцитах пациентов с АРВИ наблюдалось снижение ферментативной активности TGase-1 на 0,5–4% по сравнению с условно здоровыми людьми [13]. Гистологическое исследование кожи пациентов с ЛИ показало гиперкератоз, очаговый паракератоз, акантоз, псориазоподобную гиперплазию и наличие периваскулярных лимфоцитарных инфильтратов [36].

Пациенты с НВИЭ часто рождаются с коллодием. После отпадения коллодиевой мембраны появляются эритродермия и шелушение. При этом чешуйки обычно мелкие, белые или светло-серые, они могут быть локализованными или распространёнными по всему телу [2]. Диагностика НВИЭ также основывается на анализе структуры клеток, который показывает лёгкий или умеренный гиперкератоз, нормальный или умеренно утолщённый зернистый клеточный слой, лёгкий акантоз и вариабельный паракератоз [37].

В связи с отсутствием устойчивой корреляции генотип–фенотип и с генетической гетерогенностью АРВИ для точной диагностики требуется идентификация гена, мутация в котором привела к развитию заболевания [18]. Развитие методов пренатальной диагностики в последнее время позволяет проводить ДНК-анализ большинства распространённых форм АРВИ с использованием биопсии ворсин хориона и амниоцентеза на ранних сроках беременности с меньшим риском как для матери, так и для ребёнка. Сегодня обычным в процессе диагностики является анализ ДНК на основании мультигенной панели, охватывающей известные гены, связанные с развитием ихтиоза [38]. Если нет возможности выявить уже известные мутации, то с помощью современных ДНК-технологий можно провести частичное секвенирование экзома [39]. Благодаря обширному скринингу мутаций, связанных с ихтиозом, вызывающие заболевание варианты генов могут быть обнаружены у 90% пациентов с АРВИ [27].

ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ БИОМАРКЁРЫ АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОГО ВРОЖДЁННОГО ИХТИОЗА

Помимо явных морфологических признаков изменение барьерной функции кожи приводит к нарушению экспрессии генов цитокинов, количества иммунных клеток и липидного обмена в поражённых структурах. Перечисленные признаки можно использовать в качестве биомаркёров для диагностики и мониторинга течения АРВИ. Например, у пациентов с АРВИ обнаружены повышенная инфильтрация CD3⁺ T-клетками и дендритными клетками зон воспаления, а также повышенная экспрессия генов, кодирующих общие воспалительные маркёры, такие как интерлейкины (IL) IL-2 и IL-15, а также цитокины врождённого иммунитета IL-1β и IL-8 [40].

Известно, что активация генов сигнального пути Т-хелперов 17-го типа (Th17), а именно IL-17F и IL-36B/G, а также генов или маркёров, связанных с IL-17, синергически индуцируется IL-17 и фактором некроза опухоли α — TNF-α (а именно IL-17A/C, IL-19, C-X-C мотив хемокиновый лиганд 1 (C-X-C motif chemokine ligand 1, CXCL1), ингибитор пептидазы 3 (peptidase inhibitor 3, PI3), хемокиновый (C-C мотив) лиганд 20 (chemokine (C-C motif) ligand 20, CCL20)) в клетках пациентов с различными типами АРВИ, а также коррелирует с тяжестью заболевания [41]. Кроме того, определены характерные изменения в генах, продукты которых участвуют в метаболизме липидов (элонгаза 3 и галанин), что коррелировало со снижением внеклеточных липидов и уплотнением корнеоцитов в работе [41]. У пациентов с мутацией гена NIPAL4 обнаружено, что в роговом слое кожи количество церамидов с длиной углеродной цепи C32–52 было увеличено, тогда как количество большинства ацилцерамидов с C66:2–C72:2 — снижено [42].

МОДЕЛИРОВАНИЕ АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОГО ВРОЖДЁННОГО ИХТИОЗА IN VIVO

Для повышения эффективности симптоматической терапии и создания принципиально новых подходов к лечению врождённого ихтиоза необходима качественная, стабильная доклиническая модель, способная воспроизвести клинические проявления данного заболевания у человека.

Для определения специфических механизмов, ведущих к развитию ЛИ, была создана модель эпидермальных кератиноцитов крысы путём подавления экспрессии гена TGM1. У животных воспроизводили участки кожи, похожие на эпидермис человека. Нокдаун гена TGM1 с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК) приводил к изменению секреции компонентов рогового слоя, включая кератин 1 (keratin 1, KRT1), KRT10, инволюкрин (involucrin, IVL), а также к гиперкератозу и увеличению синтеза нейтральных липидов в органотипической культуре. Анализ таких кератиноцитов выявил активацию экспрессии гена IL-1α и увеличение секреции IL-1α у пациентов с АРВИ, включая ЛИ. Интересно, что обработка кератиноцитов антагонистом рецептора IL-1α предотвращала гиперкератоз, не влияя на уровень синтеза неполярных липидов, и это может позволить создать новые методы лечения ЛИ [43].

Получена трансгенная линия мышей Tgm1–/–, которые имеют особенности кожи, сходные с тяжёлыми формами ихтиоза у людей. Мыши погибают в первые часы жизни из-за нарушения барьерной функции кожи [44]. Исследования на мышах Tgm1–/– показали отсутствие липидной оболочки кератиноцитов, выраженный гиперкератоз и гиперплазию эпидермиса. Кроме того, обнаружено, что TGase-1 играет важную роль в формировании функционального кожного барьера. Однако исследования на таких животных необходимо проводить в неонатальном периоде [45]. Мышей Tgm1–/– следует использовать для поиска важных маркёров заболевания в качестве перспективной модели для создания новых терапевтических стратегий.

Альтернативной моделью может быть трансплантация кожи пациентов с ихтиозом лабораторным животным. С помощью тканевой инженерии и хирургических технологий получены модели со стабильным приживлением кожи человека у иммунодефицитных мышей [46]. K. Aufenvenne с соавт. [47] получили гуманизированных мышей для изучения молекулярных механизмов ЛИ с дефицитом TGase-1. Кожные трансплантаты пациентов с ЛИ приживлялись у иммунодефицитных мышей в период от 6 нед до 4 мес с сохранением всех общих морфологических признаков заболевания [48].

Исследовали прямой перенос плазмиды с геном TGM1 и трансплантацию модифицированных TGM1 кератиноцитов в интактный эпидермис пациента с ЛИ. K.A. Choate с соавт. [49] использовали кератиноциты от пациентов с дефицитом TGase-1 вместе с нормальными кератиноцитами для создания модели эпидермиса человека с ЛИ у иммунодефицитных мышей. Успешное восстановление экспрессии TGM1 может быть достигнуто обоими методами [49]. Однако трансплантация генетически модифицированных кератиноцитов превосходила прямую инъекцию экспрессионной плазмиды в отношении нормализации цитофизиологических параметров, включающих экспрессию трансглутаминазы-1, β-галактозидазы, инволюкрина и параметра трансэпидермальной потери воды [49].

Механизмы, участвующие в развитии кожных заболеваний человека и родственных заболеваний у мышей, очень схожи [50]. Кроме того, фенотип клеток кожи человека, индуцированный нокдауном гена TGM1 in vitro, очень похож на фенотип, описанный у мышей с нокдауном того же гена [51]. Считается, что модели кожных трансплантатов пациентов с ЛИ представляются более подходящими для изучения эффективности разрабатываемых препаратов для лечения ЛИ и АРВИ.

ЛЕЧЕНИЕ АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОГО ВРОЖДЁННОГО ИХТИОЗА

Симптоматическая терапия

В настоящее время терапия АРВИ направлена на снижение симптомов, улучшение качества жизни пациента без устранения основной причины заболевания, поэтому она не даёт длительного эффекта. Лечение включает применение увлажняющих средств, кератолитиков, ретиноидов, аналогов витамина D, кортикостероидов и ингибиторов кальциневрина [52].

Ретиноиды позволяют улучшить состояние кожи пациентов благодаря своей способности снижать адгезию ороговевших клеток, а следовательно, усиливать их отшелушивание, тормозить пролиферацию эпителия, способствовать нормализации терминальной дифференцировки клеток кожи. Кроме того, ретиноиды взаимодействуют с белками различных сигнальных путей, например с белком-активатором-1 [53]. Этот белок регулирует экспрессию генов, индуцирующих дифференцировку кератиноцитов, таких как TGM1, лорикрин, KRT1 и IVL [54–56].

Воспаление кожи является важной частью патоморфогенеза АРВИ. Заболевания со схожим патогенезом могут быть показательны в отношении поиска новых мишеней для противовоспалительной терапии. При сравнении биопсийного материала кожи от пациентов с АРВИ и с псориазом выявлено значительное сходство в экспрессии генов, связанных с IL-17, и маркёров, индуцированных IL-17 и TNF-α (IL-17A/C, IL-19, CXCL1, PI3, CCL20, и IL36G) [40]. Воспаление при псориазе вызывают провоспалительные цитокины, такие как IL-23, IL-17 и TNF-α, а также лимфоциты Th17 [57]. Модуляция воспаления может быть достигнута путём подавления этих цитокинов. Эффективность анти-IL-17-терапии была показана при псориатической эритродермии [58]. Таким образом, поиск новых терапевтических мишеней будет способствовать развитию таргетных, нацеленных на определённые воспалительные цитокины, препаратов для лечения ихтиоза. Например, показано, что у детей с эритродермическим ихтиозом, связанным с дефицитом ABCA12, после 6 мес лечения секукинумабом (моноклональное антитело, селективно связывающееся и нейтрализующее IL-17) произошло снижение индекса степени тяжести ихтиоза на 48%. Анализ цитокинового профиля при этом выявил снижение уровня провоспалительных цитокинов, синтезируемых кератиноцитами, и количества Th17 [59]. Безопасность секукинумаба у пациентов с ихтиозом была показана в ходе клинического исследования (NCT03041038).

Глицерин, мочевина и пропиленгликоль являются наиболее часто используемыми увлажняющими ингредиентами и обычно применяются в косметологии для симптоматического лечения ихтиоза [60, 61]. N-ацетилцистеин вместе с мочевиной показал хорошие результаты при лечении детей с ламеллярным ихтиозом [62]. Местные противовоспалительные препараты (стероиды, ингибиторы кальциневрина) часто неэффективны и вызывают привыкание [63, 64].

Лечение с использованием кожного трансплантата

Наиболее значимой аномалией век при врождённом ихтиозе является рубцовый эктропион. Прогрессирующее рубцевание и аномальное ороговение кожи век приводят к прогрессирующему вывороту обоих век, лагофтальму и обнажению роговицы. Из различных форм ихтиоза только ЛИ или АРВИ связаны с развитием эктропиона и последующей патологией органов зрительной системы. Пример успешного применения аутологичной трансплантации описан D. Uthoff с соавт. [65] при лечении рубцового эктропиона. Хирургическую коррекцию эктропиона проводили трансплантатами, взятыми с кисти, век, заушной области кожи и паха. После трансплантации клинические проявления ихтиоза на глазах были успешно устранены [65]. В работах [66–69] описан целый ряд модифицированных методик кожной пластики при этом заболевании.

Заместительная ферментная терапия

Заместительная ферментная терапия может быть эффективным методом лечения различных видов АРВИ, так как патологическое проявление заболеваний обусловлено частичным или полным отсутствием белка, необходимого для нормального ороговения эпидермиса по примеру лечения болезней накопления [70–74].

Локальная заместительная ферментная терапия ЛИ способна восстанавливать активность TGase-1 и корректировать структуру дефицитных по TGase-1 кожных трансплантатов на лабораторных животных [75]. K. Aufenvenne с соавт. [75] показали эффективность доставки рекомбинантного белка с использованием липосом для восстановления активности TGase-1 и регенерации кожи у животных с моделью ЛИ. Липосомы, загруженные TGase-1, эффективно восстанавливали активность TGase-1 в верхних стратифицированных слоях эпидермиса, повышали целостность эпидермиса и улучшали его барьерную функцию. В то же время нормализовался характер распределения ряда маркёров эпидермальной дифференцировки, таких как лорикрин, филагрин, инволюкрин и ингибитор активатора плазминогена 2 [75]. Разработаны частные модификации заместительной ферментной терапии [76, 77].

Генная терапия

Генная терапия — перспективный метод лечения АРВИ, поскольку для кожных дефектов доступны различные типы доставки генного препарата в целевые клети.

Генная терапия аутосомно-рецессивного врождённого ихтиоза с помощью доставки целевого гена вирусными векторами. Ретровирусы могут эффективно инфицировать базальные кератиноциты и обеспечивать стабильную экспрессию терапевтических генов в коже в течение нескольких циклов клеточного обновления [78, 79]. Показано, что после трансдукции ретровирусами, кодирующими ген TGM1, экспрессия и активность TGase-1 восстанавливались в мутантных кератиноцитах пациента с ЛИ in vitro [80].

В качестве безопасного и эффективного метода генной терапии ихтиоза, вызванного мутацией гена TGM1, предложен вектор на основе вируса простого герпеса 1-го типа (ВПГ-1). Вектор ВПГ-1 обладает тропностью к клеткам эпителия и может проникать в кератиноциты кожи более эффективно, чем другие вирусные векторы [81]. Кроме того, ВПГ-1 отличается низкой мутагенностью, так как его генетическая информация не интегрируется в ДНК клетки-хозяина [82]. Доклинические исследования показали, что вектор эффективно инфицирует TGM1-дефицитные клетки кожи человека и восстанавливает активность фермента TGase-1 in vitro, а также значительно повышает экспрессию TGase-1 при местном введении иммунокомпетентным мышам BALB/c [83]. При еженедельном введении в эпидермис животных вектор не распространялся в другие ткани и органы из места инъекции. В августе 2019 года было зарегистрировано клиническое исследование фазы I/II для оценки безопасности местного применения исследованного генетического вектора. На сегодняшний день это единственное зарегистрированное клиническое исследование эффективности прямой генной терапии для лечения ихтиоза (NCT04047732).

Генная терапия аутосомно-рецессивного врождённого ихтиоза с помощью невирусных методов. Невирусные методы переноса генов имеют ряд преимуществ, включая низкую токсичность, низкую иммуногенность, безопасность и экономическую эффективность по сравнению с вирусными векторами. К недостаткам этих подходов относятся короткая продолжительность экспрессии генов и низкая эффективность трансфекции [84]. Получена невирусная система доставки гена TGM1 в кератиноциты пациентов с ЛИ, которая была названа системой трансфекции, опосредованной рецептором аденовируса (adenovirus enhanced transferrinfection, AVET). Эффективность трансфекции кератиноцитов in vitro с использованием AVET составила примерно 28%, что намного лучше, чем результаты трансфекции, опосредованной другими поликатионными трансфекционными реагентами (например, SuperFect и PrimeFector). В органотипических культурах (3D-культурах) трансфекция AVET не показала ожидаемой эффективности, что могло быть связано с наличием рогового слоя или отсутствием рецептора для проникновения аденовируса [85].

Невирусный метод также использовали для доставки гена ABCA12 в кератиноциты пациентов с ИА. Мутации в гене ABCA12 обусловливают нарушение транспорта липидов, что приводит к потере кожного липидного барьера и развитию ИА или ЛИ. После генетической модификации плазмидным вектором, содержащим ген АВСА12 дикого типа, кератиноциты пациента с ИА начали экспрессировать нормальный белок АВСА12, что привело к восстановлению секреции липидов из ламеллярных гранул и улучшению фенотипа клеток [5].

Генная терапия других видов ихтиоза. Аденоассоциированные вирусы (ААВ) — наиболее часто используемые векторы для генной терапии. Они обеспечивают стабильную экспрессию без встраивания трансгена в геном клетки, обладают низкой иммуногенностью и способны трансдуцировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, в том числе кератиноциты [86, 87]. ААВ2 использовали для доставки гена ALDH3A2 в кератиноциты пациентов с синдромом Шегрена–Ларссона. Этот тип ихтиоза характеризуется мутациями в гене ALDH3A2, кодирующем длинноцепочечную альдегиддегидрогеназу [88]. Использование рекомбинантного ААВ2, кодирующего ген ALDH3A2, приводило к восстановлению функции фермента в мутантных клетках. В генетически модифицированных клетках устойчивость к альдегидам, токсичным для мутантных клеток, повышалась почти до уровня нормальных клеток [88, 89].

Вектор на основе ретровируса использован для разработки лечения Х-сцепленного ихтиоза, который характеризуется потерей функции стероидной арилсульфатазы С из-за мутаций в гене STS. Показано, что после трансплантации трансдуцированных кератиноцитов иммунодефицитным мышам полученный эпидермис гистологически эквивалентен эпидермису контрольных животных, которым пересаживали кератиноциты здорового человека. Кроме того, барьерная функция трансплантированных мутантных кератиноцитов была близка к контролю [79].

Проведено клиническое исследование (NCT01545323) [90], посвящённое трансплантации кожного графта, генетически модифицированного лентивирусным вектором, кодирующим функциональную копию гена SPINK5. Данный ген необходим для образования белка LEKTI в стволовых клетках эпидермиса при синдроме Нетертона. Показано, что нормальная форма и размер верхнего слоя кожи восстанавливались после генетической модификации дефектных кератиноцитов in vitro. Интересно, что небольшого количества клеток, несущих ген SPINK5 дикого типа, было достаточно для коррекции большой площади трансплантата. Результаты клинического испытания фазы I показали практическую применимость и безопасность генетически модифицированных эпителиальных пластов, которые были трансплантированы пациентам. Описано успешное приживление трансплантата, полностью сросшегося с окружающей кожей пациента [91].

Для лечения X-cцепленного ихтиоза был разработан вектор на основе вируса Эпштейна–Барр (ВПГ-4), кодирующий ген STS. Показано, что после генетической модификации этим вектором активность STS в базальных клетках кожи пациента с X-сцепленным ихтиозом повышалась примерно в 100 раз по сравнению с нормальными кератиноцитами [92].

Использование запрограммированных нуклеаз и малых миРНК можно рассматривать как невирусный метод генной терапии. Известно, что нокаут гена — наиболее эффективная технология редактирования генов при доминантно-негативных мутациях. Например, эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (transcription activator-like effector nucleases, TALEN), могут нацеливаться на последовательность ДНК и расщепляют её, что часто приводит к сдвигу рамки считывания и активирует нонсенс-опосредованный путь мРНК [93].

Cистему TALEN оценили на in vitro модели кератиноцитов пациента с эпидермолитическим ихтиозом, вызванным мутациями в генах KRT1 или KRT10, и на иммунодефицитных мышах с ксенотрансплантатом кожного графта in vivo. TALEN специфически воздействует на область KRT10 и приводит к полной деградации мРНК, кодируемых мутантным геном KRT10, восстанавливает стабильность промежуточных филаментов и изменяет клеточный и гистологический фенотипы [93].

Аллель-специфические миРНК также могут быть использованы для коррекции доминантно-негативных мутаций, что изучено, например, при синдроме Сентера. Это тяжёлое неизлечимое заболевание, характеризующееся поражением глаз и кожи, а также потерей слуха, с серьёзными осложнениями, такими как инфекции и рак кожи. Заболевание часто вызывается доминантно-негативными мутациями в гене GJB2, кодирующем белок щелевого контакта коннексин 26. Использование миРНК на кератиноцитах пациента приводило к сильному ингибированию мутантного аллеля гена GJB2 без изменения экспрессии аллеля дикого типа in vitro, что также было подтверждено на иммунодефицитных мышах с ксенотрансплантатом кожного графта in vivo [94].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лечение ихтиоза реализуется через симптоматическую терапию, следовательно, для поддержания кожного покрова больного в нормальном состоянии необходимо постоянное использование кератолитических и увлажняющих средств. Как традиционные, так и современные методы терапии ихтиозов мало изучены. По всей вероятности, это связано с тем, что большинство видов ихтиоза не представляют опасности для жизни больного. Несмотря на это, необходим поиск более долгосрочных и эффективных подходов к лечению АРВИ с акцентом на причину заболевания, а не только его проявления. Генная терапия и клеточная терапия — перспективные направления, но требуется большее внимание научного сообщества к этой проблеме для преодоления барьера in vitro исследований, ограничивающего большинство разработок в данной области.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Работа выполнена за счёт средств Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета («ПРИОРИТЕТ-2030»).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Благодарности. Изображение было создано с помощью BioRender.com.

About the authors

Alexey S. Ponomarev

Kazan (Volga region) Federal University

Email: l.ponomarev2013@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2320-6119
SPIN-code: 6781-7502
Russian Federation, Kazan

Daria S. Chulpanova

Kazan (Volga region) Federal University

Email: daryachulpanova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5546-840X
SPIN-code: 8917-3672

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Kazan

Alisa A. Shaimardanova

Kazan (Volga region) Federal University

Email: aliceshaimardanova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5151-7163
SPIN-code: 4321-2001
Russian Federation, Kazan

Albert A. Rizvanov

Kazan (Volga region) Federal University

Author for correspondence.
Email: rizvanov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9427-5739
SPIN-code: 7031-5996

Dr. Sci. (Biol.), Professor

Russian Federation, Kazan

Valeria V. Solovyeva

Kazan (Volga region) Federal University

Email: solovyovavv@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8776-3662
SPIN-code: 8796-3760

Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor

Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files