The influence of P2-receptors on the cytotoxic effect of cisplatine in squamous cell uterine cervix cancer in vitro

Full Text

После гибели клетки в межклеточное пространство поступают нуклеотиды (пуриновые и пиримидиновые), которые связываются с различными типами Р2-рецепторов на окружающих клетках. Различают ионотропные Р2Х-рецепторы и метаботропные Р2Y-рецепторы. Активация этих рецепторов активно влияет на ключевые внутриклеточные процессы: пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [1]. Учитывая, что значительная гибель клеток имеет место при химиотерапии опухолей, перспективно изучение влияния агонистов и блокаторов Р2-рецепторов на чувствительность опухолевых клеток к химиопрепаратам. Целью нашего исследования являлось оценить действие агониста (АТФ) и блокаторов (сурамин, PPADS и RB2) Р2-рецепторов на количество погибших клеток плоскоклеточного рака шейки матки на фоне влияния цисплатина in vitro. Материал и методы Источником биологического материала служили биоптаты плоскоклеточного рака шейки матки, полученные от 3 первичных больных. Фрагменты опухолевой ткани были диссоциированы методом ферментативной дезагрегации с использованием 0,5 % раствора трипсина (Sigma, США). Опухолевые клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 3 мин. Клетки высевали в среду DMEM с 10 % фетальной сывороткой и инкубировали при 37°С в СО2 инкубаторе. Мы использовали методику кратковременной инкубации опухолевых клеток [2] со следующими препаратами: сурамин (неселективный антагонист P2X- и P2Y-рецепторов) 0,1 мМ, Reactive Blue 2 (антагонист P2Y-рецепторов) (Sigma, США) 0,1 мМ, цисплатин (противоопухолевый цитостатик) 20 мкг/мл, АТФ (неселективный агонист Р2-рецепторов) (Sigma, США) 0,1 мМ, а так же их комбинации. Контрольные значения получали без инкубации с химиопрепаратами. Через 24 ч инкубации оценивалось количество погибших клеток, для чего в культуру клеток был добавлен 1% трипановый синий, который проникает через поврежденную цитоплазматичекую мембрану и окрашивает погибшие клетки. Подсчет клеток производился в нескольких полях зрения с использованием инвертированного микроскопа МИБ-Р (ЛОМО). Статистическую обработку полученных данных выполняли с применением описательных методов; сравнение групп по количественным признакам выполняли с применением параметрических методов (t-критерий Стьюдента). е-mail: raginovi@mail.ru Результаты Через 24 ч инкубации количество погибших клеток под влиянием цисплатина достоверно превышало контрольные значения в 2,2 раза (рис. 1А). Под действием АТФ количество погибших клеток достоверно превысило данный показатель в контрольной группе в 2 раза. При введении неселективного блокатора Р2У-рецепторов RB2 количество погибших клеток уменьшалось по сравнению с контролем на 52,1% (р<0,05) (рис. 1А). Под действием блокатора P2Y- и Р2Х-рецепторов сурамина, а также блокатора Р2Х-рецепторов PPADS количество погибших Рис. 1. Количество погибших клеток рака шейки матки под влиянием: цисплатина и отдельных препаратов, влияющих на Р2-рецепторы (А) и комбинаций этих препаратов (Б). По оси ординат - количество погибших клеток в процентах от общего числа клеток. Пунктирная линия - значение в группе с цисплатином (Ц). Примечание: А: * - различия при сравнении с контролем статистически значимы (р<0,05). Б: * - различия при сравнении с группой с цисплатином статистически значимы (р<0,05); ** - различия при сравнении с группой цисплатин+АТФ статистически значимы (р<0,05) ЛИТеРАТУРА: клеток не отличалось от контроля. На фоне влияния цисплатина количество погибших клеток при добавлении АТФ увеличивалось в 2,7 раза (рис. 1Б), а при добавлении RB2 - достоверно уменьшалось на 41%. Ни сурамин, ни PPADS не изменяли количества погибших клеток от совместного действия АТФ и цисплатина (рис. 1Б). обсуждение В отношении опухолевых клеток показаны разнонаправленные эффекты действия пуринергической системы. Так, её активация при помощи АТФ стимулирует гибель клеток меланомы и рака простаты [3, 4], но введение селективного антагониста Р2Х7-рецепторов - бриллиантового голубого G - в 2 раза уменьшает размер глиомы у экспериментальных животных [5]. Полученные нами данные указывают, что АТФ в концентрации 0,1 мМ стимулирует гибель клеток плоскоклеточного рака шейки матки. Количество гибнущих клеток под влиянием блокатора P2Y-рецепторов RB2 уменьшается, а при инкубации с неселективным блокатором Р2-рецепторов сурамином и блокатором Р2Х-рецепторов PPADS не изменяется, что указывает на большее значение P2Y-рецепторов, чем Р2Х-рецепторов для гибели клеток рака шейки матки. Этот факт подтверждается данными об уменьшении в клетках рака шейки матки уровня экспрессии Р2Х-рецепторов по сравнению с интактным эпителием шейки матки [6]. При совместном применении цисплатина и АТФ количество погибших клеток имеет наибольшее значение и значительно превосходит суммарное действие по отдельности, что, вероятно, связано со значительным выделением нуклеотидов из большего числа погибших клеток и запуском апоптоза в окружающих клетках (эффект «домино»). При добавлении RB2 к клеткам, инкубированным с цисплатином или цисплатином+АТФ, наблюдается снижение количества умерших клеток. Введение сурамина и PPADS, в отличие от RB2, не приводило к подобному эффекту, что ещё раз указывает на значимость именно P2Y-рецепторов в потенциировании цитотоксического действия цисплатина в отношении плоскоклеточного рака шейки матки. Благодарности Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров.

About the authors

I. S Raginov

Kazan State Medicale University; Kazan (Volga region) Federal University

G. K Muhamedyarova

Kazan State Medicale University

A. V Panov

Kazan State Medicale University

References

Supplementary files