Инфицированность пуповинной крови и тканей эмбрионов ранних сроков гестации и гемопоэз в эмбриональной печени

Полный текст

Введение

Источниками стволовых клеток, применяемых в клеточной трансплантологии, являются костный мозг, пуповинная кровь, плацента и абортивные эмбрионы ранних сроков гестации и др. Чистота получаемых клеточных препаратов гарантирует качественное использование их в клинике. Однако уровень инфекционного поражения населения очень высок. Особенно распространены урогенитальные инфекции среди людей детородного возраста. В рекомендациях МОЗ Украины требуется обследовать донорскую кровь на наличие инфекционной флоры (гепатиты В и С, ВИЧ, трепонема) методом иммуноферментного анализа [ИФА]. Мы сочли необходимым провести более широкие исследования пуповинной крови с помощью полимеразной цепной реакции [ПЦР] [1, 2].

До недавнего времени считалось, что наиболее частыми возбудителями внутриутробных инфекции являются цитомегаловирусы, вирусы простого герпеса 1 и 2 типов, возбудители токсоплазмоза и краснухи. Однако результаты последних исследований во многом изменили представления, как об этиологической структуре внутриутробных инфекций, так и о частоте внутриутробного инфицирования в целом.

Целью нашей работы было определение инфекционного агента в образцах пуповинной крови и плаценте, поступивших на длительное хранение в криобанк согласно договору с пациентами [3] с помощью методов ПЦР и ИФА, а также влияние инфицирования на гемопоэз в печени эмбрионов.

Материал и методы

Проведен сравнительный анализ инфицированности пуповинной крови и абортивных эмбрионов и плодов 6-12 недель гестации, полученных с согласия женщин во время добровольного прерывания беременности и подготовленных для клинических испытаний клеточных препаратов. Образцы хранились в криобанке при температуре -196°С. Исследование клеточного состава популяции гемопоэтических клеток при наличии и отсутствии инфекций выполнено на мазках, окрашенных по Романовскому, под иммерсией при увеличении х400 на микроскопе СX41 Olympus.

Пероксидазную активность определяли бензидиновым методом [4].

Для ПЦР-анализа, включающего выделение РНК/ДНК, амплификацию и детекцию результатов, использованы тест-системы производства ЦНИИЭ Роспотребнадзора (АмплиСенсиТМ, Россия). Для выделения РНК (гепатит 0) был использован комплект «Рибозоль-А», для ДНК - комплекты «ДНК-Сорб-В» и «Цитолизин». Детекцию результатов проводили методом гибридизационно-ферментного анализа [ГИФА] (для гепатита С и ВИЧ), а также методом электрофореза.

Некоторые образцы были дополнительно подвергнуты иммуноферментному анализу. Контроль стерильности проводили по классическим микробиологическим методикам [1]. Оценку статистической значимости различий между вариантами производили с использованием критерия Стьюдента при Р< 0,05.

Результаты и обсуждение

Договор на длительное хранение в криобанке пуповинной крови мы заключаем с роженицами, у которых не обнаружено патогенной флоры. Однако даже в таких случаях, мы выявляем у женщин возбудителей. Из полученных нами данных, следует, что из 55 исследованных образцов цитомегаловирус определили в тканях плаценты в 7,2% случаев, в пуповинной крови вирус не выявлен. Вирус Эпштайна-Барр [ВЭБ] также не обнаружен в крови, но найден в плаценте (3,6%). РНК вируса гепатита С найдена в 3,6% пуповинной крови и 5,4% - в плаценте, причем во всех случаях в анамнезе рожениц не было сведений о наличие инфекционных заболеваний.

Если роды протекали с осложнениями: ранний отход вод, длительное нахождение плода в безводной среде, околоплодные воды с запахом и измененным цветом, при бактериологическом контроле пуповинной крови и плаценты отмечено присутствие бактериальной флоры, т.е. пуповинная кровь (6,6%) и плацента (25,5%) были нестерильными.

Многие авторы считают, что урогенитальные и вирусные инфекции попадают в презервируемые ткани гематогенным путем, а бактериальная флора - восходящим (контаминация) при родах. Существует также мнение, что для будущего ребенка опасны инфекции, с которыми женщина встретилась во время беременности, а инфицирование до беременности, кроме хронических очагов в мочеполовой сфере, не опасно. Дальнейшие наши исследования показали возможность попадания вирусов в эмбрион до формирования полноценной плаценты.

Мы провели исследование абортивных эмбрионов и установили следующее: наиболее распространенной инфекцией является микоплазма (Mycoplasma hominis) (17%), возбудитель выявляется с 6 по 12 недели внутриутробного развития в тканях печени, почек, сердца, головного мозга и в кроветворных клетках. 5% эмбрионов были поражены хламидиями, 6% - уреаплазмой, 4% - гепатитом С, 2,5% - ВЭБ, выявилось большое количество смешанных инфекций. В целом, 47% исследованных нами эмбрионов и плодов были заражены различными видами микроорганизмов, которые определялись уже на 6-10-й неделях развития.

Изменения в клетках, вызванные возбудителями, не могут быть безразличными для будущего ребенка. При поражениях вирусом гепатита С вирус локализуется в печени, оказывая на гепатоциты цитопатическое действие, следствием которого может быть появление в них большого количества вакуолей и многоядерности. При заражении хламидиозом увеличивается количество моноцитов и макрофагов. Следует особо отметить, что при исследовании тканей ИФА- методом в 10 и 11 недельных эмбрионах, инфицированных ВИЧ и вирусом гепатита С, были обнаружены антитела к данным возбудителям. В образцах, содержащих хламидии, уреаплазму, микоплазму, антитела выявлены лишь единично на 11-12-й неделе.

При изучении морфофункциональной характеристики популяции гемопоэтических клеток эмбриональной печени различных сроков развития (от 5 до 12 недели) и различной стерильности, мы выделили три группы:

• не определяя инфекционного загрязнения в пробах;
• в чистых препаратах;
• в образце, пораженном вирусом гепатита С;

Морфологический и цитохимический анализ клеточной популяции в первой группе, показал большое разнообразие клеток от недифференцируемых бластов, лимфоцитоподобных клеток до зрелых макрофагов и нейтрофилов.

В отпечатках и мазках печени 5-6-недельных эмбрионов обнаружена довольно высокая доля недифференцируемых бластных клеток (17,0±1,5%), они были представлены крупными клетками округлой формы с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Лимфоцитоподобные клетки составляли 4,0±0,6%, на 7-8-й неделях развития количество клеток этой группы статистически достоверно не изменялось, а с 9 по 12-ю недели число недифференцируемых бластных и лимфоцитоподобных клеток снижалось до 6,0±0,6% и 2,0±0,2 %, соответственно (Р< 0,05). Это снижение, по-видимому, связано с увеличением массы органа и количества гемопоэтических клеток, происходит «разведение» популяции более дифференцированными клетками-предшественниками гемопоэза. Лимфоциты встречались единично только на 11-12 неделях развития (1,2±0,4 %].

Примитивные эритробластические элементы при выявлении пероксидазной активности давали в зависимости от типа клеток различные оттенки желтого окрашивания (от ярко-желтого в эритробластах I типа, до желто-коричневого в эритробластах III типа). Эти клетки представляли почти половину клеточной популяции на 5-6 неделях развития, затем к 7-8 неделям количество их снижалось. Различие было статистически достоверным на 8-12 неделях. Данная генерация эритроидных клеток заменялась клетками дефинитивного эритропоэза, которые на 5-6 неделях составляли 14,0±1,3%, а к концу 12-й - 52,0±5,0% (Р < 0,05].

На 5-8 неделях развития около 20% клеток были представлены клетками моноцитарно-макрофагального ростка, затем число их достоверно снижалось. Количество моноцитов на 11-12 неделях составляло 2,6±0,4%, а макрофагов - 6,0±1,7%. В мазках также встречались единичные мегакариоциты и миелобластные элементы.

Таким образом, если не принимать во внимание наличие инфекционной флоры в образцах, усредненная популяция гемопоэтических клеток эмбриональной печени 5-12-недельного возраста представлена клетками эритроидного ряда, находящимися на разной стадии развития, моноцитарно-макрофагальными и в меньшей степени миелоидно-гранулоцитарными клетками.

При анализе препаратов, изготовленных из образцов, в которых методом ПЦР не обнаружено наличие вирусов и урогенитальных инфекций, мы не выявили того разнообразия клеток, который присутствовал в первой группе. В мазках встречались клетки эритроидного и моноцитарно-макрофагального ростка. Небольшая доля недифференцируемых бластных и лимфоцитоподобных клеток. Клетки миелоидного ростка найдены в единичных количествах в 11-12-недельных плодах.

Отсутствие раннего грануло-цитопоэза в этой группе может быть обусловлено тем, что у эмбриона/плода в отсутствие инфекционного агента снижается необходимость в этом типе клеток. Однако гемопоэтические клетки-предшественники эмбриональной печени могут дифференцироваться в различные клеточные линии и этот запрет, как мы увидим далее, может быть снят при появлении внутриутробной инфекции.

В третьей группе [образцы инфицированные вирусом гепатита С] клеточный состав резко изменен: увеличивалось количество клеток моноцитарно-макрофагального ростка, появлялись миелоидные предшественники, зрелые гранулоциты и эозинофилы. Аналогичные результаты получены при анализе мазков из образцов, пораженных другими видами инфекций.

Проведенные исследования позволили установить, что ряд возбудителей проникает в эмбрион на ранних сроках гестации, до полного формирования плаценты. Как осуществляется на данном этапе эмбрионального развития механизм защиты эмбриона от инфекции? У здорового человека попадающие в организм вирусы и микроорганизмы не всегда могут быть причиной болезни. Они распознаются и разрушаются в течение нескольких часов благодаря механизмам врожденного иммунитета, которые не являются антигенспецифическими и не требуют длительного времени для их активации. Эта ранняя фаза ответа на инфекцию помогает сохранять ее под контролем до активации антигенспецифических лимфоцитов [5].

Пиогенные микроорганизмы [пневмококки, стафилококки, стрептококки и др.] элиминируются благодаря нейтрофилам, иммуноглобулинам и комплементу. Внутриклеточные возбудители разрушаются Т-лимфоцитами, NK-клетками и макрофагами, причем все эти 3 группы клеток обладают способностью синтезировать цитокины [интерферон, ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-а и др.], резко усиливающие их функциональные свойства. Т-лимфоциты появляются у плода на 12-й неделе внутриутробного периода, после этого срока плод способен проявлять слабые реакции гиперчувствительности замедленного типа и отторжения трансплантата.

При изучении влияния инфекционных агентов на репродуктивную систему женщин было установлено, что уреаплазмы, микоплазмы, вирус простого герпеса, обнаруженные в эндометрии, вызывают морфофункциональные изменения в его клетках, задержку формирования маточно-плацентарного кровотока, что свидетельствует о восходящем пути инфицирования, т.е. из полости матки, и приводит к «замершей» беременности [6].

Если происходит имплантация бластоцисты в пораженный инфекцией эндометрий, в инфицированных эмбрионах включается механизм врожденного иммунитета, который запускает пролиферацию клеток-предшественниц грануломоноцитопоэза, увеличивается количество моноцитов, макрофагов, а также стимулируется миелопоэз, отсутствующий в норме на данном этапе развития эмбриона.

Следовательно, в эмбриональной печени среди недифференцируемых бластных и лимфоцитоподобных клеток присутствуют ранние предшественники гемопоэза, способные пролиферировать и дифференцироваться в необходимый организму кроветворный росток. Они образуют в 30 раз больше колоний, чем клетки пуповинной крови и в 90 раз больше, чем гемопоэтические клетки костного мозга [7]. Кроме того, эмбриональные гемопоэтические клетки обладают высоким потенциалом самовоспроизводства, что имеет большое значении при их клиническом применении [8].

Таким образом, мы установили, что инфекционные агенты могут проникать в эмбрион на ранних стадиях гестации. Присутствие патогенов вызывает изменения в клетках эмбриональной печени, которая в 1 триместре беременности является основным кроветворным органом. Изменяется направленность дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественниц, поэтому, при исследовании эмбрионального кроветворения, чтобы избежать разногласий в приводимых данных, необходимо тщательно подбирать исходный материал, предварительно тестируя его на различную патогенную флору современными методами.

Кроме того, крайне важно проводить тщательное микробиологическое обследование молодых пар, планирующих рождение ребенка, чтобы, в случае выявление возбудителя провести адекватное лечение до наступления беременности, а не в 1 триместре, когда уже может иметься внутриутробное инфицирование плода.

Об авторах

Г. С. Лобынцева

Автор, ответственный за переписку.
Email: info@eco-vector.com
Украина, Киев

Список литературы

Дополнительные файлы