Повышение эффективности заселения биодеградируемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками при динамическом культивировании

Полный текст

Введение Использование тканеинженерных конструкций в экспериментальных и клинических исследованиях является более успешным при реализации принципа биомиметичности: создании многослойных структур и имитации естественной микросреды [1]. Для создания полых трубчатых органов (по классификации Э. Аталы - второй уровень сложности для конструирования [2]) применяют 30-конструкции, состоящие из внутреннего эпителиального слоя, среднего - гладкомышечного и наружного - соединительнотканной волокнистой оболочки. При создании многослойной конструкции общего желчного протока (ОЖП) будет достаточно использовать только эпителиальные и стромальные клетки, так как гладкомышечные встречаются, в основном, только в верхней части ОЖП и около сфинктера Одди [3]. Известно, что для оптимальной пролиферации эпителиальных и стромальных клеток необходимо подбирать наилучшие параметры поверхностей матрикса-носителя [4]. Важным фактором достижения положительного эффекта является способ культивирования, направленный на повышение эффективности заселения матрикса клетками. инамическое культивирование включает методы, использующие гидростатические силы (механическое перемешивание среды, ротационное, перфузионное культивирование при центрифугировании), давление (вакуумное культивирование) и их комбинации [9, 10]. Для скрининга - первичного тестирования биоматериалов, необходимо применять стандартные линейные культуры клеток, влияние на которые оценивается по уровню их повреждения, пролиферации, состоянию клеточных структур, специфическим аспектам клеточного метаболизма [11]. Целью данной работы являлось повышение эффективности заселения разработанных биодеградируемых матриксов стромальными и эпителиальными клетками. материал и методы Материалы матриксов и способы их получения Для изготовления плоских образцов пористых матриксов были использованы следующие полимеры: 1) ацетат целлюлозы (АЦ) содержащий 39,7% ацетильных групп, 50 кДа, (Sigma Aldrich); 2) поли-капролактон (ПКЛ), 80 кДа, (Sigma Aldrich); 3) сополимер D.L-лактида с гликолидом 75:25 (ПДЛГА), 76-115 кДа, (Sigma Aldrich); 4) сополимер □ Л-лактида с гликолидом состава 70:30 (НБИКС-центр Курчатовского института), 104 кДа (ПДЛГА+); 5) сополимер L-лактида с s-капролактоном (ПЛК) состава 70:30, (Corbion Purac). Экспериментальные образцы изготавливали методом электороформования на лабораторной однокапиллярной установке. После изготовления, перед исследованием их структуры все образцы вакуумировались при разрежении 1 мбар в течение 1 сут. Полученные матриксы были стерилизованы гамма-излучением в дозе 15 кГр в контейнерах «Клинипак». Структура приготовленных микроволокнистых матриксов была исследована методом сканирующей электронной микроскопии (Helios 600i, FEI, США). Геометрические размеры волокон определяли при анализе полученных изображений с помощью программы Scope Photo. Средний диаметр волокна рассчитывался по результатам измерения 70-100 волокон. Культуры клеток Для скринингового тестирования матриксных свойств использовали следующие клеточные линии: MCF-7 - эпителиальная линия опухолевых клеток протока молочной железы человека, одна из наиболее часто используемых в исследованиях линий клеток с характеристиками дифференцированного эпителия; 3T3/NIH - стандартная линия спонтанно иммортализованных фибробластов, полученная из эмбриональных тканей мыши. Статичное и динамическое культивирование Клетки MCF-7 и 3T3 культивировали в CO2-инкубаторе в течение 7 суток в стандартных условиях при температуре 37°C, 5% CO2 и увлажненной атмосфере. Полная питательная среда состояла из □MEM/F12 (Gibco) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco) и 1% пенициллина/стреп-томицина (Gibco). Матриксы были исследованы при двух типах культивирования: статичное культивирование в стандартной посуде и динамическое культивирование при медленном осевом вращении цилиндрической пробирки. Подсчет клеток осуществляли в счетчике ТС-10 (Bio-Rad). Стандартные размеры образцов матриксов получали путем вырубки ручным пробойником (Micron) круглых мембран диаметром 0,3 см2. Клетки засевали в концентрации 14x103 кл/см2 для 3Т3, 24x103 кл/см2 для McF-7 на образцы матриксов в виде круглых мембран диаметром 0,3 см2. Статичное культивирование осуществляли в 96-луночном планшете с объёмом 200 мкл питательной среды в каждой лунке. При проведении динамического культивирования (при вращении) в криопробирки объемом 1,6 мл с неадгезивной поверхностью помещали по 3 образца матрикса и засевали клетки в той же концентрации (абсолютное число клеток было, соответственно, в 3 раза выше). Объём культуральной среды был, соответственно, также увеличен в 3 раза (600 мкл). Вращение осуществляли с помощью программируемого ротатора RM-1 (Elmi), помещенного в СО2-инкубатор (Thermo Fisher Scientific), со следующими параметрами: тип вращения - равномерный; направление относительно оси симметрии - вдоль оси симметрии пробирки; скорость вращения - 3 об/мин. Определение пористости волокнистых матриксов и размера пор Определение пористости проводили на образцах размером 4x4 см. Толщину материалов определяли с помощью толщиномера марки ТР-25-100Б. Вес образцов измерялся на аналитических весах Sartorius CPA324S-0CE с точностью 0,1 мг. Расчет пористости образцов производили из отношения между объемом, занимаемым волокнами и объемом всего материала в процентах. Размер пор образцов определяли методом точки пузырька. Оценка пролиферации клеток на матриксах Пролиферацию клеток на 7 сутки культивирования исследовали путем проведения МТТ-теста. Для точной оценки количества клеток, прикрепившихся к матриксу, содержимое каждой лунки аккуратно переносили в соответствующую лунку нового 96-лу-ночного планшета, вносили 200 мкл питательной среды, исключая, таким образом, из измерения клетки, прикрепившиеся к пластику. В каждую лунку добавляли по 50 мкл МТТ-реагента и инкубировали в течение 4 ч. при 37°С, что приводило к образованию нерастворимых в воде фиолетовых кристаллов. Далее среду удаляли, вносили по 200 мкл ДМСО для растворения кристаллов, и полученный окрашенный раствор в объёме 100 мкл переносили в 96-лу-ночный планшет. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific) при длине волны 540 мм. Отрицательным контролем служили лунки без клеток, наполненные полной питательной средой. Из каждой криопробирки удаляли питательную среду, для удаления живых не прикрепившихся клеток вносили по 600 мкл свежей среды и по 150 мкл раствора МТТ (1 мг/мл). Инкубировали в течение 4 ч. при 37°С, на дно криопробирок и материал образцов выпадали фиолетовые нерастворимые в воде кристаллы формазана. Центрифугировали криопробирки 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость аккуратно удаляли отсасыванием, вносили 600 мкл ДМСО (Sigma) для растворения кристаллов и получали окрашенный раствор, который переносили в 96-луночный планшет по 100 мкл/лунку от каждой пробы. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific) при длине волны 540 мм. Отрицательным контролем служили лунки без клеток, наполненные полной питательной средой. результаты Характеристика матриксов В ходе исследования были изготовлены пять матриксов из ПКЛ, один - из АЦ, 2 - из ПДЛГА, 2 - из ПДЛГА+, 2 - из ПЛК; всего - 12 образцов (рис. 1, табл. 1.). У образцов № 3-ПКЛ, № 11, 12-ПЛК были выявлены дефекты волокнистой структуры, поэтому определение среднего диаметра волокон проводили только на неповрежденных участках. Матриксы № 1, 5, 6-ПКЛ; № 4, 10-ПДЛГА; № 7-АЦ; № 8, 9-ПДЛГА+ обладали исключительно волоконной структурой, тогда как № 3-ПКЛ и № 11, 12-ПЛК содержали овальные структуры, локализованные на волокнах и представлявшие собой недо-вытянутые участки (утолщения) волокон. Образец № 2-ПКЛ имел вид сложной композиции, состоящей из ленточных волокон большой ширины и тонких волокон с приблизительно круглым сечением. Поверхность волокон матриксов № 8, 9-ПДЛГА имела пористое строение. Образцы № 1, 5, 6-ПКЛ характеризовались бимодальностью, т.е. в их структуре присутствовали волокна разного диаметра, что особенно заметно в матриксе № 6-ПКЛ. Пролиферация клеток на матриксах Полученные матриксы были ко-инкубированы с различными видами линий клеток и оценены с помощью МТТ-теста при статичном и динамическом культивировании (рис. 2, табл.2). Рис. 1. Матриксы, полученные электроформованием: № 1-3, 5, 6 - ПКЛ; № 7 - АЦ; № 8, 9 - ПДЛГА+; № 4, 10 - ПДЛГА; № 11, 12 - ПЛК. Сканирующая электронная микроскопия таблица 1. Свойства волокнистых матриксов, полученных электроформованием № образца Полимер Средний диаметр волокна (M±a), мкм Размер пор (max), мкм Пористость, % Толщина материала, мкм Удельная площадь поверхности, м2/г 1 ПКЛ 14,5±6,5 80 90 770 0,23 2 ПКЛ 12,1±7,1 38,7 79 250 0,28 3 ПКЛ 0,44±0,24* 9,3 85 180 - 4 ПДЛГА 5,3±1,3 38 81 400 0,59 5 ПКЛ 3,6±2,2 36 83 530 0,86 6 ПКЛ 1,3±1,5 33 90 860 2,53 7 АЦ 6±2,4 38,7 95 700 0,51 8 ПДЛГА+ 2,7±1,1 7,3 84 230 1,15 9 ПДЛГА+ 3,5±1,2 10,2 84 480 0,91 10 ПДЛГА 4,2±1,6 16,6 81 220 0,75 11 ПЛК 0,48±0,38* - 83,2 210 - 12 ПЛК 1,8±1,2* - 83,6 430 - - средний диаметр волокон между недовытянутыми грушевидными участками. ЗТЗ, статичное культивирование ■ ЗТЗ, культивирование при вращении ■ MCF-7, статичное культивирование ■ MCF-7 Культивирование при вращении Рис. 2. Количество клеток (х103) линий 3Т3 и MCF-7 на 7 сут. при культивировании в статичном и динамическом режимах, рассчитанное по значениям оптической плотности при МТТ-тесте таблица 2. Оптическая плотность при МТТ-тесте на 7 сут. культивирования клеток линий 3Т3 и MCF-7 на полученных матриксах Матриксы Оптическая плотность № образца Полимер 3Т3, статичное культивирование 3Т3, динамическое культивирование MCF-7, статичное культивирование MCF-7 динамическое культивирование 1 ПКЛ 0,429 0,586 0,537 1,212 2 ПКЛ 0,471 0,536 1,071 1,501 3 ПКЛ 0,364 0,541 0,69 1,14 4 ПДЛГА 0,277 0,742 0,423 1,112 5 ПКЛ 0,262 0,559 0,267 0,569 6 ПКЛ 0,269 0,494 0,508 0,742 7 АЦ 0,669 0,346 1,437 0,66 8 ПДЛГА+ 0,318 0,444 0,265 0,664 9 ПДЛГА+ 0,215 0,401 0,278 0,518 10 ПДЛГА 0,212 0,761 0,243 0,928 11 ПЛК 0,448 0,974 0,465 2,319 12 ПЛК 0,538 0,805 0,753 1,514 Статичное культивирование. Наибольший уровень пролиферации клеток линии 3Т3 наблюдался на образцах № 1-ПКЛ, № 2-ПКЛ, № 7-АЦ, № 11-ПЛК, № 12-ПЛК, а клеток MCF-7 - на матриксах № 2-ПКЛ, № 3-ПКЛ, № 7-АЦ, № 12-ПЛК. Образцы на основе материала ПДЛГА и ПДЛГА+ показали более низкие результаты роста клеточных культур 3Т3 и MCF-7. На основании полученных данных, можно сделать вывод, что при статичном культивировании наибольшей пролиферативной активностью обладали клетки, заселенные на материалы ПКЛ, ПЛК и АЦ. Динамическое культивирование. Наибольшая скорость пролиферации клеток 3Т3 наблюдалась на матриксах из ПДЛГА (№ 4, 10), а также ПЛК (№ 11, 12), наименьшее количество клеток - на матриксе из АЦ № 7. Наибольший прирост эпителиальных клеток MCF-7 при культивировании с вращением был выявлен на образцах № 2-ПКЛ и № 11, 12-ПЛК. На основании исследования можно сделать вывод, что наибольшая адгезивная и пролиферативная активность клеток 3Т3 определялась на матриксах из ПКЛ, ПДЛГА и ПЛК; а для клеток MCF-7 на образцах из ПКЛ и ПЛК. Заселение клетками в зависимости от диаметра волокон матриксов На матриксах из ПКЛ для клеток MCF-7 при статичном культивировании наблюдали восходящую динамику пролиферации клеток, отличающуюся на 100% при переходе от диапазона волокон 0 0,3- 2,7 мкм к 5-21 мкм. Значения первого диапазона (среднее значение оптической плотности 125) соответствовали 104 клеток, а второго (среднее значение оптической плотности 220) - 20х103 клеток. Аналогичная динамика наблюдалась для 3Т3, при которой пролиферация клеток в диапазоне волокон большего диаметра была выше на 100-150% (45х103 клеток по сравнению с 15х103 клеток). При культивировании в условиях вращения данная зависимость сохранялась: так, на матриксах из ПКЛ для клеток MCF-7 наблюдали восходящую динамику пролиферации, отличающуюся на 150% при переходе от диапазона волокон 0 0,3-2,7 мкм к 5-21 мкм. Значения первого диапазона (среднее значение оптической плотности 220) соответствовали 20х103 клеток, а второго (среднее значение оптической плотности 320) - 50х103 клеток. Разница в пролиферации 3Т3 на исследуемых матриксах при различных диаметрах волокон отсутствовала, но уровень пролиферации был значительно выше, по сравнению со статичным культивированием (50- 60х103 кл. для каждого образца). При статичном культивировании MCF-7 и 3Т3 не было выявлено разницы в пролиферации клеток на матриксах из полилактогликолидов, обладавших диаметром волокон в пределах 1,6-6,0 мкм. обсуждение Методом электроформования были получены 12 типов матриксов из разных полимеров или сополимеров, которые представляли собой плоские каркасы-мембраны из волокнистого нетканого материала с пористостью от 79 до 95% и средним диаметром волокон от 0,44 до 14,5 мкм. Данные параметры матриксов были выбраны по результатам исследований механической прочности, которая соответствовала прочности нативных желчных протоков (неопубликованные данные). Матриксы были исследованы с использованием двух принципиально разных линий клеток: эпителиальных MCF-7 и фибробластоподобных 3T3/NIH - путем проведения МТТ-теста. Матриксы не обладали цитотоксическим эффектом. Для заселения матриксов применяли два способа культивирования - стандартное статичное и динамическое культивирование с вращением по разработанному нами режиму. Заселение матриксов было более эффективным при вращении для всех образцов, кроме образца № 7-АЦ, который при статичном культивировании демонстрировал наиболее высокие значения пролиферации клеток, а при вращении - низкие. Это может быть связано с низкими адгезионными свойствами поверхности данного матрикса, в результате чего часть клеток не удерживалась на его поверхности при вращении. Таким образом, режим динамического культивирования также может быть использован при тестировании адгезионных свойств материалов и позволит выбирать оптимальные для дальнейшего заселения клетками в ротируемых и проточных биореакторах. В ряде работ было показано, что размер пор и степень пористости матрикса влияют на эффективность его заселения клетками [14, 15]. Большинством исследователей оптимальным размером пор носителя считается диапазон от 50 до 150 мкм. Размер пор определяет не только эффективность заселения материала клетками, но также влияет на их морфофункциональную активность [14]. Чем крупнее поры носителя, тем проще, быстрее и равномернее можно произвести заселение его клетками [15]. Показано, что миграция клеток линейно зависит (до определенного уровня) от размера пор [16]. Кроме того, крупные поры способствуют лучшей адгезии клеток к поверхности носителя и в дальнейшем лучшей жизнеспособности клеток после трансплантации конструкции [17]. В нашей работе были исследованы матриксы с меньшим размером пор, что было необходимо для соответствия прочности матрикса нативному желчному протоку. Все образцы матриксов были одинаково высокопористыми (табл. 1), что не позволило оценить влияние данного параметра на их адгезионные свойства. В отношении диаметра волокон в матриксах из поликапролактона, в котором можно было четко выделить 2 диапазона размеров, было отмечено, что при переходе от диапазона диаметра волокон 0 0,3-2,7 мкм к 5-21 мкм - клетки (как при статичном, так и при динамическом культивировании) пролиферировали значительно лучше, что может быть связано с «эффективной» площадью для их адгезии. Данный результат не противоречит имеющимся литературным данным, в которых на эндотелиальных клетках было показано, что оптимальным диапазоном диаметра электроформованных волокон из АЦ - 0 1-5 мкм. Диапазон выбран, исходя из максимальных размеров диаметра волокон в трех исследованиях (10-200 нм, 0,2-1 мкм, 1-5 мкм) [18]. заключение В данной работе проведено исследование ряда перспективных для тканевой инженерии биодеградирующих полимеров: ПКЛ, АЦ, ПДЛГА, ПДЛГА+, из которых электроформованием были изготовлены образцы матриксов в виде мембран с различной пористостью и размерами волокон. При скрининговом исследовании с использованием линий 3Т3/ NIH и MCF-7 было подтверждено отсутствие цитотоксичности матриксов и выбраны наиболее подходящие для заселения фибробластоподобными и эпителиальными клетками: для первых - из ПЛК, для вторых № 2-ПКЛ и № 12-ПЛК. При статичном культивировании MCF-7 и 3Т3 не было выявлено разницы в пролиферации клеток на матриксах из полилактогликолидов, обладавших диаметром волокон в пределах 1,6-6,0 мкм. Полученные результаты будут применены для дальнейших исследований по созданию многослойного тканеинженерного эквивалента желчного протока. благодарности Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (соглашение о субсидии № 14.604.21.0133, уникальный идентификатор RFMEFI60414X0133).

Об авторах

А. В Люндуп

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Институт регенеративной медицины

Москва, Россия

А. Г Демченко

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Институт регенеративной медицины

Москва, Россия

Т. Х Тенчурин

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Москва, Россия

М. Е Крашенинников

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Институт регенеративной медицины

Москва, Россия

И. Д Клабуков

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Институт регенеративной медицины

Москва, Россия

А. Д Шепелев

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Москва, Россия

В. Г Мамагулашвили

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Москва, Россия

Р. В Оганесян

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Институт регенеративной медицины

Москва, Россия

А. С Орехов

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Москва, Россия

С. Н Чвалун

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Москва, Россия

Т. Г Дюжева

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Институт регенеративной медицины

Москва, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы