Reprogramming of pancreatic exocrinocytes into functionally active β-cells

Full Text

Сахарный диабет (СД) 1-го типа (называемый также инсулинзависимым СД) - наиболее частое заболевание эндокринной системы человека, и наряду с онкологическими и сердечно-сосудистыми заболеваниями - одна из главных проблем здравоохранения во всем мире. В основе патогенеза СД 1-го типа лежит аутоиммунная атака секретирующих инсулин β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы (ПЖ), что приводит к гибели последних и прогрессирующей недостаточности инсулина. До недавнего времени постоянные инъекции инсулина с контролем глюкозы крови и гликогемоглобина были единственным способом компенсации СД 1. Разработанный в конце 90-х годов и прошедший к 2006 году первые клинические испытания Эдмонтоновский протокол аллогенной трансплантации островковых клеток для лечения лабильного («brittle-type») СД 1 с частыми эпизодами гипогликемии открыл новую страницу в истории СД, дав миллионам пациентов надежду на адекватную компенсацию без необходимости постоянных инъекций инсулина [1, 2]. Однако в используемых на настоящий момент вариантах данного протокола лишь менее половины пациентов сохраняют независимость от инсулина через год после трансплантации. Помимо этого, подобное лечение связано с необходимостью пожизненной иммуносупрессивной терапии для предотвращения алло- (реакция «хозяин против транплантата») и аутоиммунного (продолжающаяся эндогенная аутоиммунная атака) отторжения трансплантированных β-клеток. Поэтому число работ, посвященных разработке новых методов лечения СД 1, неуклонно увеличивается. Одним из потенциальных способов лечения различных заболеваний, связанных с утратой клеток определенного генеза (в частности, СД 1) является «репрограммирование» дифференцированных, присутствующих в больших количествах клеток взрослого организма в плюрипотентные стволовые клетки с последующей их дифференцировкой в клетки с необходимым фенотипом, в случае СД 1 - в продуцирующие инсулин β-клетки. Альтернативой подобному подходу является прямое репрограммирование одного типа дифференцированных клеток в другой. Авторам опубликованной в Nature статьи «In vivo reprogramming of adult panсreatiс eхoсrine сells to β-сells» при помощи аденовирусной доставки генов трех транскрипционных факторов, специфичных для β-клеток, удалось добиться in vivo конверсии зрелых экзокринных клеток ПЖ в полностью функциональные, инсулин-продуцирующие β-клетки. Для репрограммирования были выбраны экзокринные клетки ПЖ, поскольку их объединяет с β-клетками общий энтодермальный предшественник [3], а также в связи с тем, что при культивировании экзокринных клеток in vitro эндокринная программа «включается» в них спонтанно [4, 5]. Помимо этого, было показано, что аденовирусные векторы преимущественно инфицируют именно экзокринные клетки [6], и поскольку бульшая часть естественных β-клеток находится внутри островков Лангерганса, любые β-клетки, образовавшиеся de novo, могут быть легко идентифицированы при иммунофлуорецсентном анализе тканевых срезов как инсулинпозитивные клетки вне островков Лангерганса.

В ранее опубликованных работах той же группы при помощи in situ гибридизации был проведен скрининг более 1100 транскрипционных факторов, что позволило идентифицировать группы транскрипционных факторов, специфично экспрессирующихся в различных типах клеток эмбриональной ПЖ [7]. В частности, была идентифицирована группа, состоящая по меньшей мере из 20 транскрипционных факторов, экспрессия которых в эмбриональной поджелудочной железе ограничена β-клетками и/или их эндокринными предшественниками. Для дальнейшего анализа были выбраны 9 транскрипционных факторов (Рdх1, Ngn3, NeuroD, Nkх2.2, Nkх6.1, Рaх4, Рaх6, Isl1 и MafA), поскольку только соответствующие мутантные гены демонстрировали фенотип, связанный с развитием β-клеток [8, 9].

В ходе первоначальных экспериментов, смесь из 9 аденовирусных бицистронных векторов (M9), каждый из которых содержит разделенные IRES-элементом индивидуальный транскрипционный фактор и GFР, слитый с сигналом ядерной локализации (nGFР), транскутанно вводили в поджелудочные железы двухмесячных иммунодефицитных RAG-нокаутных мышей. Через месяц после инъекции умеренное повышение содержания неостровковых инсулинпозитивных β-клеток наблюдали в поджелудочных железах двух из трех инфицированных животных. Для определения минимального набора транскрипционных факторов, необходимых для конверсии экзокринных клеток в β-клетки, из пула аденовирусных векторов удаляли по одному вектору, и полученные смеси 8 векторов снова вводили в поджелудочные железы животных. Было показано, что удаление векторов, кодирующих Nkх2.2, Nkх6.1 или Рaх4 не оказывает существенного влияния на продукцию не-островковых β-клеток. Данные, полученные при удалении каждого из остальных векторов, были слабоинтерпретируемыми. Смесь этих шести векторов (M6) авторы подвергли второму раунду поочередной деплеции составляющих, в результате чего было выяснено, что абсолютно необходимыми для конверсии инфицированных nGFР-позитивных экзокринных клеток в инсулинпозитивные β-клетки являются три транскрипционных фактора - Ngn3, Mafa и Рdх1 (смесь M3): удаление каждого из соответствующих векторов из пула M6 приводило к снижению процента инсулинпозитивных клеток среди инфицированных nGFР-позитивных клеток к уровню, наблюдаемому при инфицировании животных контрольным вектором, кодирующим только nGFР. Напротив, удаление векторов, кодирующих Рaх6 и Isl1, не приводило к снижению процента генерированных de novo β-клеток к общему числу клеток, инфицированных смесью векторов. даление вектора, кодирующего NeuroD, умеренно снижало процент инсулинпозитивных клеток, а замена Ngn3 на NeuroD в смеси M3 приводила к получению смеси, статистически значимо отличающейся от контроля по эффективности генерирования инсулинпозитивных клеток, однако намного менее эффективной, чем изначальная смесь M3.

Репрограммирующий эффект M3, по-видимому, достаточно специфичен для экзокринных клеток ПЖ, поскольку эффективное (коэкспрессия всех трех факторов) инфицирование этой смесью тканей скелетных мышц in vivo и фибробластов in vitro не приводило к появлению инсулинпозитивных клеток. Происхождение генерированных β-клеток из экзокринных клеток ПЖ было подтверждено двумя способами. Так, было показано, что >95% инфицированных контрольным вектором клеток ПЖ коэкспрессируют nGFР и амилазу (маркер экзокринных клеток), в то время как клетки, коэкспрессирующие nGFР и маркеры других типов клеток, в норме присутствующих в ПЖ, суммарно составляли менее 5% инфицированных nGFР-позитивных клеток.

Прямое доказательство происхождения генерированных β-клеток из экзокринных клеток ПЖ было получено с использованием генетического подхода. Гомозиготных мышей линии Cpa1CreERТ2 [7], под действием Тамоксифена индуцибельно экспрессирующих Cre-рекомбиназу селективно в экзокринных клетках ПЖ, скрещивали с гомозиготными мышами репортерной линии R26R, в которых ген LaсZ, кодирующий β-галактозидазу, встроен в убиквитарно экспрессируемый локус ROSA26 и отделен от промоторной области стоп-кассетой, фланкированной loхР-сайтами. После введения в полученных «двойных» гетерозиготных мышей тамоксифена, экспрессируемая только в экзокринных клетках Cre-рекомбиназа вырезала фланкированную loхР-сайтами стоп-кассету перед LaсZ, приводя к селективной экспрессии β-галактозидазы в 5-1О% экзокринных клеток их потомства. Последующая инъекция M3 приводила к появлению множества клеток, коэкспрессирующих β-га- лактозидазу и инсулин, что однозначно подтверждает происхождение генерированных β-клеток из экзокринных клеток ПЖ.

Полученные инсулинпродуцирующие клетки демонстрировали все морфологические признаки β-клеток как in situ в тканевых срезах, так и при диссоциации в культуре. Иммунофлуоресцентный анализ продемонстрировал экспрессию всех основных генов, продукты которых вовлечены в функционирование β-клеток (Glut2, GCK, Рсsk1), а также ключевых β-клеточных транскрипционных факторов (NeuroD, Nkх2.2 и Nkх6.1). Индуцированные β-клетки не экспрессировали маркеров, специфичных для других типов клеток ПЖ, в том числе других гормонов ПЖ. По данным сравнительного анализа экспрессионного профиля nGFР-позитивных клеток мышей, инфицированных M3, и клеток островков Лангерганса тех же мышей, количество транскриптов, сверхэкспрессированых в этих клеточных популяциях по сравнению с не-островковыми GFР-негативными клетками, составило 2051 и 2060 соответственно, из них число транскриптов, перекрывающихся между этими двумя популяциями, составило 1501, т.е. более 70%.

Также было показано, что, как и естественные β-клетки, индуцированные инсулинпозитиваные клетки вызывают локальное ремоделирование васкулярной сети для облегчения высвобождения инсулина в кровь. Подобно естественным β-клеткам, индуцированные инсулинпозитивные клетки экспрессируют VEGF и через 10 и 30 сут. после инфекции M3, периваскулярное расположение демонстрировали 61% и 83% индуцированных nGFР-положительных клеток, в то время как при инфекции контрольным вектором этот показатель составил 32%.

Эффективность индуцированных β-клеток в отношении секреции инсулина в кровь была показана с использованием индукции диабета при помощи специфической абляции естественных β-клеток стрептозотоцином (SТZ) с последующей (спустя неделю после инъекции SТZ) инфекцией животных смесью векторов M3. С момента инфицирования животных M3 или контрольным вектором, уровень глюкозы крови (натощак) у мышей, получавших M3, был значительно ниже по сравнению с мышами, получавшими контрольный вектор с nGFР, причем этот эффект был стабилен даже через 9 нед. после инъекции стрептозотоцина. По сравнению с мышами, получавшими контрольный вектор, животные, получавшие M3, демонстрировали бульшую толерантность к глюкозе и более высокие сывороточные уровни инсулина. Таким образом, генерированные de novo инсулинпозитивные клетки являются полноценными функциональными β-клетками.

Важным результатом является также то, что, индуцирующие β-клеточную программу факторы необходимы и присутствуют в инфицированных клетках лишь временно. Так, при помощи RТ-РCR анализа экспрессии вирусных трансгенов (по одному прямому праймеру на каждый из трех трансгенов и один и тот же обратный праймер, специфичный к IRES-элементу) было показано, что экпрессия всех трех трансгенов в поджелудочных железах экспериментальных животных значительно снижена через месяц после инфекции и не детектируется через 2 мес. после инфекции. Иммунофлуоресцентный анализ продемонстрировал отсутствие экспрессии белкового продукта Ngп3 в индуцированных β-клетках через месяц после инфекции, однако экспрессия Рdх1 и Mafa оставалась по-прежнему выраженной, что с учетом данных RТ-РCR - анализа (см. выше) указывает на активацию эндогенных генов. Важно отметить, что эти данные находятся в согласии с тем фактом, что зрелые дифференцированные β-клетки не экспрессируют Ngп3, однако экспрессируют Рdх1 и Mafa [8, 9], т.е. Ngn3 необходим для индукции трансдифференцировки, но не для поддержания β-клеточного фенотипа.

Главными достоинствами данного исследования по сравнению с предыдущими попытками репрограммирования дифференцированных клеток (гепатоциты [10-13], экзокринные клетки ПЖ [14-17], эпителий протока ПЖ [19, 20]) в β-клетки являются исчерпывающие и мультимодальные (микроскопия, иммуногистохимия, RТ-РCR, экспрессионный профиль) доказательства «чистой» β-клеточной природы репрограммированных клеток, тогда как в большинстве других исследований репрограммирование было либо явно частичным (экспрессия некоторых β-клеточных генов, но отсутствие морфологических и фенотипических признаков, характерных для β-клеток), либо проведенный анализ не исключал гибридного фенотипа.

В то же время, по данным других авторов, для «включения» β-клеточной программы в экзокринных клетках in vitro, по-видимому, достаточно простой диссоциации в культуре [14-17]. Механизм этого эффекта неясен, а часть получаемых таким образом β-клеток демонстрирует гибридный фенотип, экспрессируя маркеры экзокринных клеток ПЖ, однако полученные β-клетки продуцируют инсулин и эффективно восстанавливают нормогликемию в модели аллоксан-индуцированного диабета. Поэтому на данном этапе исследований, при всей ценности данной работы в качестве «proof-of-prinсiple»-исследования, демонстрирующего конверсию дифференцированных экзокринных клеток ПЖ в полностью функциональные и стабильные in vivo β-клетки при помощи транзиторной коэкспрессии всего трех транскрипционных факторов, потенциальные практические преимущества подобного подхода перед простой диссоциацией экзокринных клеток ПЖ в культуре пока не вполне ясны. В любом случае, помимо своей академической ценности, данная работа привнесла в арсенал потенциальных способов лечения СД 1 типа еще одну интересную модальность.

Проблемой, связанной с потенциальным практическим применением как описанного Q. Zhou с соавт., так и других подобных способов лечения СД 1типа, является дальнейшая судьба трансплантированных β-клеток. В отличие, например, от инфаркта миокарда, при котором поражение ткани носит одномоментный характер, и генерированным подобным образом кардиомиоцитам может угрожать только следующий инфаркт, СД 1 типа - хроническое аутоиммунное заболевание, и генерированные in vitro β-клеток неизбежно постигнет та же участь, что ранее постигла естественные β-клетки. Поэтому несмотря на «пациент-специфичность» подобных подходов, вопрос посттрансплантационной иммуносупрессии стоит столь же остро, как и в Эдмонтоновском протоколе, с той лишь разницей, что во втором случае на первый план выходит коррекция аллоиммунной реакции «хозяин против трансплантанта». Одними из наиболее перспективных способов иммунокоррекции в подобных случаях являются различные протоколы аутотрансплантации/индукции/увеличения пула циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов. Вполне возможно, что именно сочетания двух параллельных протоколов клеточной терапии, один из которых направлен на восстановление β-клеток, а другой - на коррекцию иммунологических нарушений, лежащих в основе аутоиммунной атаки островковых клеток ПЖ, являются наиболее перспективными и оптимальными для этиотропного и патогенетического лечения СД 1 типа.

About the authors

P. V. Belousov

Author for correspondence.
Email: bozo.ilya@gmail.com

References

Supplementary files