Features of DNA repair in dermal fibroblasts in ataxia-telangiectasia patients with mosaic type of manifestation of active ATM kinase

Full Text

Мозаицизм проявляется наличием в пределах одного организма клеток с разным генотипом и, как правило, является следствием соматических мутаций, митотического кроссинговера или нарушений сегрегации хромосом в митозе. При этом мутации одиночных генов или хромосомные аберрации могут локализоваться в отдельных клетках организма или клеточных популяциях, а не во всех клетках организма. На организменном уровне проявление фенотипических особенностей мозаицизма иногда интерпретируется, как «вариант нормы» или лёгкая степень заболевания, когда доля мутантных клеток в ткани крайне мала. Дауна (OMIM: 190685). Полученные несколькими лабораториями данные позволяют полагать, что мозаичная нейрональная анэуплоидия и последующий апоптоз могут лежать в основе потери нейронов при многих ней-родегенеративных заболеваниях: болезни Альцгеймера (OMIM:104300), синдроме Секкеля 1, 3-10 типов (OMIM: 210600, 606744, 613676, 613823,614728, 614851, 615807, 616777, 617253), атаксии-телеан-гиэктазии (OMIM: 208900), синдроме Неймегеновского повреждения (OMIM: 251260) и синдроме Нимана-Пика типа С (OMIM:257220) [1, 2]. Одним из наследственных заболеваний, диагностика которого затруднена из-за полиморфности его проявлений и большого количества патогенных мутаций, является атаксия-телеангиэктазия (AT1, Луи-Бар синдром, OMIM: 208900). AT - тяжелое мультисистемное нейродегене-ративное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования, возникающее из-за мутаций в гене АТМ Ataxia telangiectasia mutated) в компаунд-гетерозигот-ном или гомозиготном состоянии. Мутации в гене АТМ представлены множеством фенотипов, отражающих тяжесть заболевания и различную симптоматику. Для AT характерны хромосомная нестабильность, высокий риск канцерогенеза, чувствительность клеток пациентов с АТ (АТ-клеток) к воздействию ионизирующего излучения (ИИ) и их аномальная устойчивость к ингибированию синтеза ДНК после рентгеновского облучения. Последний признак используется для определения групп комплементации при классической форме заболевания [3], четыре из которых (A, C, D и E) относятся к хромосоме 11q23 [4] и связаны с мутациями в гене АТМ [5]. Также для большинства форм заболевания характерны повышенный уровень альфа-фетопротеина и дефицит иммуноглобулинов [6]. Для типичной формы АТ тяжесть заболевания обычно зависит от возраста пациента, однако описаны атипичные фенотипы АТ, при которых дефект киназы АТМ и нарушение фаз клеточного цикла после генотоксического стресса выражены в меньшей степени, чем у пациентов с типичной формой АТ [7]. Ген АТМ, расположенный в хромосомном локусе 11q22.3, кодирует серин-треониновую киназу АТМ, которая принадлежит к надсемейству фосфатидилинозитол- 3-киназ связанных киназ (PIKK) [8, 9] и играет важную роль в клеточном ответе на двунитевые повреждения ДНК, в функционировании как не повреждённых клеток, так и поврежденных после облучения, а также участвует в хромосомном обмене через мультикомпонентные узелки рекомбинации [1 0]. Киназа АТМ обладает собственной протеинкиназной активностью и может напрямую связывать белок р53, отвечая за его фос-форилирование по серину 1 5 и способствуя активации и стабилизации белка р53 во время ИИ-индуцированного ответа на повреждение ДНК. Активация киназы АТМ инициирует ответ клеток на облучение, однако она не всегда связана с разрывами нитей ДНК, а может происходить в результате изменений в структуре хроматина [10]. Одним из важным белков-мишеней киназы АТМ является P53-связывающий белок 1 (53BP1), выполняющий функцию адаптера (медиатора), необходимого для обработки сигнала-ответа на повреждение ДНК, который рекрутируется в ядерные структуры в месте повреждения ДНК и образует легко визуализируемые очаги-«фокусы». Низкий уровень белка 53BP1 приводит к остановке клеточного цикла в фазе G2/M, а также нестабильности генома в клетках млекопитающих. Кроме того, белок 53BP1 является «платформой» для привлечения других факторов восстановления после повреждения ДНК. В последнее время считается, что белок 53BP1 играет важную роль в выборе пути восстановления двунитевых разрывов ДНК [11]. Учитывая полиморфность клинических проявлений АТ, затрудняющих диагностику этого заболевания, и наличие других генетических заболеваний со сходным фенотипом, разработка недорогих диагностических методов остаётся актуальной. ранее в нашей лаборатории был разработан метод диагностики АТ, основанный на определении в дермальных фибробластах активной формы киназы АТМ - pATMSer1981. Были выявлены мозаичные формы АТ и описана корреляция нарушения функции киназы АТМ с уровнем содержания гистона H3K27me3 и деаци-тилазы SIRT6. Для апробации метода использовали линии дермальных фибробластов, полученные из биоптатов кожи здоровых доноров разных возрастов и пациентов с другими генетическими заболеваниями, связанными с нарушением репарации ДНК. Во всех случаях, кроме АТ, максимальный клеточный ответ pATMSer1981 на повреждение ДНК наблюдали через 30 мин. после воздействия ИИ [12, 13]. Целью работы было изучение нарушения репарации ДНК в клеточных линиях дермальных фибробластов, выделенных из биоптатов кожи пациентов с клинически поставленным диагнозом атаксия-телеангиэктазия. Материал и методы Дизайн исследования В исследование были включены 5 пациентов с диагностированными различными формами АТ на стадии нечетко выраженной клинической картины заболевания. В дальнейшем (в некоторых случаях через несколько лет) у всех пациентов был подтверждён диагноз АТ либо с помощью молекулярно-генетических методов анализа, либо клинически. У пациентов были отмечены такие симптомы заболевания, как атаксия, телеангиэктазия, пониженный иммунитет (частые простудные заболевания); были выявлены множественные хромосомные аберрации; уровень альфа-протеина в крови больных был выше нормы. У пациента AT9SP есть старший сибс с АТ в тяжёлой форме. Пациенту с формой заболевания AT13SP изначально был поставлен диагноз ATLD1 (единственный симптом заболевания - атаксия), однако молекулярногенетический анализ подтвердил диагноз АТ. Клеточные линии дермальных фибробластов были получены миграционным методом из биоптатов кожи 5 пациентов сразу после постановки диагноза АТ: 3 пациентов в возрасте 2 лет-AT1SP, AT11SP, AT13SP; 1 пациента в возрасте 6 лет AT9SP и 1 пациента в возрасте 7 лет AT10SP. Контролем служили дермальные фибробласты, полученные из биоптатов кожи 2 здоровых доноров в подходящем возрастном интервале: мальчика 5 лет (N10SP) и мужчины 23 лет (N8SP). Обязательным критерием включения в группу здоровых доноров являлось отсутствие наследственных и хронических заболеваний. Малочисленность контрольной группы объясняется трудностью получения материала от детей и тщательностью отбора здоровых доноров. биоптаты кожи от пациентов с АТ забирали под местным обезболиванием по просьбе лечащего врача и родителей пациентов в разных медицинских учреждениях. забор материала у ребенка-донора проводили в послеоперационный период (под общей анестезией), у взрослого донора - под местной анестезией. От родителей детей-пациентов, ребенка-донора и от взрослого донора было получено информированное согласие. В клеточных линиях методом непрямой иммунофлюоресценции определяли количество, интенсивность, площадь фокусов pATMSer1981 и 53BP1, а также количество клеток с активной формой киназы АТМ. Получение клеточных линий фибробластов кожи миграционным методом биоптаты кожи помещали в чашки Петри, заливали полной ростовой питательной средой MEM (Gibco, США), содержащей 1 5% бычьей эмбриональной сыворотки (Gibco, США), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/ мл стрептомицина (Gibco, США), 25 мкг/мл фунгизона, 0,3 мг/мл L-глутамина, и культивировали в СО2-инкубаторе при +370С в атмосфере с 5% СО2 до получения субконфлюентного монослоя. Далее клетки ополаскивали раствором фосфатно-солевого буфера (ФСб), снимали с чашек Петри при помощи 0,25% раствора трипсин-версена (Gibco, США) и рассевали на покровные стёкла (Carl Zeiss, Германия). Повреждение ДНК Для выявления способности киназы АТМ активироваться в ответ на повреждение ДНК клетки подвергали рентгеновскому облучению в дозе 2 Гр на установке рАП-150/300-14 (россия). Очаги повреждения ДНК называют (ионизирующими) очагами, индуцированными радиацией (IRIF или RIF), или очагами репарации ДНК. После повреждения ДНК синтезируются белки-участники ответа или их модифицированные формы, которые накапливаются в местах двухцепочечных разрывов ДНК и могут быть визуализированы с помощью иммуноцитохимии. Такие очаги называют «фокусами» («foci») [14]. Для изучения особенностей репарации ДНК в клеточных линиях анализировали следующие параметры фокусов: количество, площадь и интенсивность флуоресценции. Иммуноцитохимический анализ Через 30 мин., 1,5 ч., 6 ч. и 24 ч. после облучения, согласно стандартному протоколу и аннотации к использованию антитител, клетки фиксировали на льду 4% раствором формальдегида в течение 10 мин. при +40С с последующей фиксацией ледяным 70% раствором этанола на ФСб (15 мин. при комнатной температуре), промывали растровом ФСб, пермеабилизовали 1,5% раствором тритона X-100 на ФСб (15 мин. при комнатной температуре), промывали раствором ФСб 3 раза по 5 мин. и инкубировали в блокирующем растворе 5% БСА на ФСб (1 ч. при комнатной температуре) с последующим промыванием ФСб. В качестве первых антител использовали IgG мыши к фосфорилированной форме белка АТМ-киназы - pATMSer1981 (Thermo Scientific, СШа) и IgG кролика к белку p53BP1 (Abcam, Великобритания). В качестве вторых антител использовали антитела козы против IgG мыши или кролика, коньюгированные с Alexa Fluor 488 и 546 (Invitrogen, США) в разведении 1:500. Для предотвращения быстрого выгорания иммунофлюоресцентных красителей препараты заключали в антифейдиг с помощью реагента SlowFade Gold Antifade с DAPI (Invitrogen, США). Контролем служили интактные клетки (без облучения). Изображения с окрашенных препаратов получали с помощью флюоресцентного инвертированного микроскопа AXIOVERT200-DFC420 (Carl Zeiss AG, Германия), оснащенного камерой Leica DFC 420 и объективом х40/0,75. Подсчет количества клеток без фокусов pATMSer1981 и p53BP1 проводили вручную. Количество фокусов, их площадь и интенсивность флюоресценции анализировали в программе DARFI, которая была выбрана в результате сравнительного анализа нескольких программ: IPLab, Fiji, DARFI, FoCo и CellProfillera, как программа с наименьшей субъективной составляющей, зависящей от человеческого фактора [15, 16]. Количество фокусов в клетке также подсчитывали «вручную». Секвенирование нового поколения (NGS) В клеточных линиях, полученных из биоптатов кожи пациентов с AT1SP, AT9SP, AT10SP и AT13SP, методом секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS) и в клеточной линии, полученной из биоптатов кожи пациента AT11SP, методом NGS секвенирование с использованием панели «клинический экзом» (секвенатор Illumina, США), был проведён анализ генов ATM, MRE11A, RAD50, NBS1, CETX, APTX и BRAT1 на наличие патогенных мутаций. Мутации (замены), выявленные методом NGS секвенирования, подтверждали секвенированием по Сэнгеру в ООО «Геноналитика» (автоматический капиллярный секве-натор ДНК ABI 3730, Applied Biosystems, США) и проверяли на патогенность в программах NetGen2, Human Splicing Finrer, SIFT, Polyphen-2; Provean. Статистический анализ Для каждой временной точки было проведено сто измерений в трёх повторах, за параметр статистического анализа было выбрано стандартное отклонение средних значений на одну временную точку. Статистический анализ выполняли в программах Gogle Sheets, DARFI, Excel и Origin. Результаты Секвенирование нового поколения Количество ридов и глубина прочтения при использовании метода NGS секвенирования составляли для пациента AT1SP - 1124901/96, AT9SP - 13268976/110, AT10SP - 12168935/98 и AT13SP - 12357962/98; при использовании NGS секвенирования с панелью «клинический экзом» для пациента AT11SP - 68675976/10. В клеточных линиях AT1SP, AT9SP, AT10SP и AT13SP методом NGS секвенирования (пациенту с AT10SP дополнительно проводили полногеномное секвени-рование) выявляли замены в генах ATM, MRE11A, RAD50, NBS1, CETX, APTX и BRAT1. При проверке в программах на патогенность выявленных замен только у двух пациентов были обнаружены патогенные мутации: у пациента AT11SP в гене АTM - c.875C>T (p. Pro292Leu) и c.6772_6773delCT S2259Yfs*13; и у пациента AT13SP в гене АТМ - c.1564_1565delGA и c.5188C>T. Все выявленные мутации были подтверждены секвенированием по Сэнгеру. Оценка степени нарушения функциональной активности гена АТМ: репарационные кривые для фокусов pATMSer1981 и 53BP1 Возникновение и элиминация фокусов pATMSer1981 и 53BP1 в клетке являются важным показателем степени повреждения ДНК, а также состояния репарационных процессов [17]. Построение репарационных кривых позволяет наиболее полно оценить репарационные возможности клеток (рис. 1-8, 10, 11). Временные диапазоны и доза ИИ были подобраны исходя из литературных и наших данных: максимальное количество фокусов pATMSer1981 и 53BP1 в клетках здорового донора обычно наблюдается через 30 мин. после облучения, а через 1 сут. репарационная кривая возвращается к исходной точке. В клеточных линиях определяли количество фокусов в клетке, их площадь, интенсивность флюоресценции и проводили сравнительных анализ по средним значениям параметров фокусов между клеточными линиями пациентов, донора-ребенка и взрослого донора, пациентов и доноров. Количество фокусов рис. 1. Количество фокусов pATMSer фибробластах, полученных из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров, M±o, подсчет вручную рис. 2. Количество фокусов 53BP1 в дермальных фибробластах, полученных из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров, M±o, подсчет вручную рис. 3. Количество фокусов pATMSer фибробластах, полученных из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров, M±o, подсчет в программе DARFI 1 в дермальных 1 вдермальных Количество фокусов pATMSer1981 и 53BP1 подсчитывали как «вручную» (рис. 1, 2), так и при помощи программы DARFI (рис. 3, 4). В некоторых клеточных линиях данные среднего значения количества фокусов на клетку, полученные разными способами, существенно отличались. Это объясняется возможностью программы задать размер фокуса и более точно определить число фокусов в большом кластерном фокусе (объединение нескольких фокусов в один крупный). По усредненному показателю количества фокусов pATMSer1981 и 53BP1 на клетку была выявлена задержка клеточного ответа на повреждение ДНК во всех линиях АТ по сравнению с клеточной линией донора-ребенка: максимум среднего значения количества фокусов на клетку у пациентов с АТ был зарегистрирован через 1,5-6 ч., а у донора-ребенка - через 30 мин. после облучения (рис. 1-4). Во всех клеточных линиях, кроме AT1 SP, было показано, что значение среднего количества фокусов 53BP1 существенно выше, чем pATMSer1981. Полученный результат может свидетельствовать о том, что 53BP1 вовлечён в репарацию не только двунитевых повреждений ДНК, но и менее тяжёлых - однонитевых разрывов и изменений структуры хроматина. При построении репарационных кривых по усредненному показателю количества фокусов на клетку в некоторых линиях было обнаружено два «пика», что можно объяснить «волновым эффектом повреждений ДНК»: сначала происходит репарация более мелких фокусов, которые появляются раньше, а затем репарация более крупных и кластерных фокусов, которые обычно появляются позже. Рис. 6. Интенсивность флюоресценции фокусов 53BP1 в дермальных фибробластах, полученных из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров, M±o, подсчет в программе DARFI Рис. 4. Количество фокусов 53BP1 в дермальных фибробластах, полученных из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров, M±o, подсчет в программе DARFI Рис. 5. Интенсивность флюоресценции фокусов pATMSer1981 в дермальных фибробластах, полученных из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров, M±o, подсчет в программе DARFI Наименьшие значения показателя среднего количества фокусов pATMSer1981 на клетку на всех временных интервалах были выявлены в клетках линии пациента с наиболее тяжёлой формой заболевания (AT11SP). Интенсивность флюоресценции фокусов Важным для понимания тяжести повреждения ДНК является показатель интенсивности флюоресценции фокусов (рис. 5, 6), который измеряется в относительных единицах флуоресценции (О.Е.Ф.). Препараты клеток разных клеточных линий, окрашенных антителами к белкам pATMSer1981 и p53BP1, фотографировали в одно и то же время с использованием эталонного стекла, чтобы минимизировать возможность влияния фактора снижения интенсивности лампы микроскопа. Было обнаружено, что средние значения интенсивности флюоресценции фокусов pATMSer1981 на клетку отличались как между клеточными линиями доноров, так и между клеточными линиями доноров и пациентов с АТ. В клетках взрослого донора на всех временных интервалах, кроме 24 ч., средние значения интенсивности флюоресценции фокусов pATMSer1981 были примерно в два раза выше, чем у донора-ребёнка. Во всех клеточных линиях пациентов с АТ средние значения интенсивности флюоресценции были значительно выше, чем у донора-ребенка. рис. 7. Площадь фокусов pATMSer фибробластах, полученных из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров, M±o, подсчет в программе DARFI рис. 8. Площадь фокусов 53BP1 в дермальных фибробластах, полученных из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров, M±o, подсчет в программе DARFI 1 в дермальных Следует отметить, что показатели интенсивности флюоресценции фокусов pATMSer1981 и 53BP1 в исследуемых клеточных линиях АТ, кроме AT13SP, не коррелировали друг с другом, как у здоровых доноров. Площадь фокусов О степени тяжести повреждения ДНК также можно судить по такому показателю, как площадь фокуса (рис. 7, 8), которая измеряется в пикселях. Средние значения показателя площади фокусов pATMSer1981 у доноров в интактных клетках и через 1 ,5 ч. после облучения, достоверно друг от друга не отличались. Также не было достоверного различия между показателями среднего значения площади фокусов pATMSer1981 во всех клеточных линиях пациентов с АТ и взрослого донора. Показатель среднего значение площади фокусов pATMSer1981 в клетках донора-ребёнка достоверно превышал этот показатель только в клетках двух исследуемых линий АТ. Возможно, отсутствие достоверных различий по усредненному показателю площади фокусов pATMSer1981 объясняется мозаичным проявлением активной формы киназы АТМ. Картина распределения средних значений площади фокусов 53BP1 в клетках доноров была прямо противоположной: в клетках донора-ребенка этот показатель был в 2-2,3 раза больше, чем в клетках взрослого донора, что подтверждает роль белка 53BP1 в сохранении стабильности генома и указывает на уменьшение его количества с возрастом. Доля клеток с фокусами pATMSsr1981 и б3вР1в клеточных линиях Доля клеток с фокусами pATMSer1981 является ещё более важным показателем репарационных возможностей ДНК, т. к. без образования активной формы киназы АТМ практически невозможна репарация двунитевых разрывов ДНК. На разных временных интервалах была определена доля клеток без фокусов pATMSer1981 и 53BP1 (рис. 9-11). рАТМ Seri 981 DAPI 53ВР1 без фокусов / без фокусов бс* фокусов Тч без фокусов \\ / без фоку со ~Ч:Л IPpgT, ATI SP AT9SP ATIOSP ATI 1SP ATI3SP N8SP N1 OSP Рис. 9. Дермальные фибробласты, выделенные из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров: иммуноцитохимическая реакция с антителами к белкам pATMSer1981 и 53BP1; клетки без фокусов pATMSer1981 отмечены стрелками. Ядра клеток докрашены DAPI. Ув.х400 pATMSer из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров (%), подсчет вручную Рис. 11. Доля дермальных фибробластов без фокусов 53BP1 в культурах, полученных из биоптатов кожи пациентов с АТ и здоровых доноров (%), подсчет исследователем вручную Рис. 10. Доля дермальных фибробластов без фокусов 1 в культурах, полученных В клетках донора-ребенка через 30 мин. и 1,5 ч. после облучения во всех клетках были детектированы фокусы pATMSer1981 и 53BP1, в то время, как в клетках взрослого донора эти фокусы появлялись только через 1,5 ч. В клетках пациентов с АТ на всех временных интервалах фокусы pATMSer1981 обнаружены не были. Однако элиминация фокусов 53BP1 во всех клетках была выявлена через 30 мин. после облучения в клеточной линии AT13SP, выделенной из биоптата кожи пациента, которому первоначально был поставлен диагноз ATLD1. Количество клеток без фокусов pATMSer1981 у здоровых доноров в интактных клетках и через 1 сут. после облучения достоверно не отличалось. Однако количество клеток с элиминированными фокусами 53BP1 у ребенка-донора как в интактных клетках, так и через 1 сут. после облучения, было больше, чем у взрослого донора. Данный факт также указывает на то, что с возрастом количество белка 53BP1 уменьшается. различия между пациентами АТ и здоровыми донорами по усредненным показателям количества фокусов, их площади и флюоресценции, а также по доле клеток без фокусов pATMSer1981 и 53BP1 , вероятно, связаны с тем, что у пациентов с АТ киназа АТМ выполняет свои функции не в полной мере и сигнальный путь идёт опосредованно, через другие киназы, такие как ATR, которая может частично восполнять функцию киназы АТМ при репарации двунитевых разрывов ДНК [18]. Обсуждение В некоторых случаях при диагностике АТ сложно поставить точный диагноз из-за несовершенства методов молекулярно-генетического анализа и большого количества мутаций в гене АТМ. Иногда до постановки точного диагноза проходит несколько лет, пока не проявятся более чёткие клинические признаки заболевания. Учитывая полиморфность заболевания, разработка и усовершенствование методов анализа in vitro c использованием клеточных линий актуальна. В нашей работе у всех пациентов с АТ была детектирована доля клеток без активной формы киназы АТМ. Наименьшая доля клеток без фокусов pATMSer1981 в линиях АТ была зарегистрирована через 1 ,5 ч. после воздействия ионизирующего излучения: 21% (AT1SP), 2% (AT10SP), 8% (AT11SP) и через 6 ч.: 8% (AT9SP и AT13SP) (рис. 10). Также во всех клеточных линиях пациентов с АТ была доказана задержка клеточного ответа на повреждение ДНК по сравнению с клеточными линиями доноров. В клеточной линии с самой тяжелой формой АТ (AT1SP) была выявлена наибольшая доля клеток без активной формы киназы АТМ (рис. 10) В линии пациента с тяжёлой формой АТ (AT13SP) на временных интервалах 1,5 ч. и 6 ч. доля клеток без фокусов pATMSer1981 была достаточно высокой, но меньше, чем у пациента AT1SP (рис. 10). Несмотря на то, что неспособность клетки синтезировать активную форму киназы АТМ в ответ на повреждение ДНК является серьёзным нарушением репарации ДНК, наши результаты не позволяют напрямую говорить о корреляции между тяжестью формы АТ и доли клеток без фокусов pATMSer1981. Необходимо учитывать общие характеристики репарационных способностей ДНК: среднее количество фокусов, площадь фокусов и интенсивность их флюоресценции на всех временных интервалах. Более детальное исследование репарации ДНК, учитывая такие показатели фокусов, как площадь и интенсивность их флюоресценции, а не только их количество [11, 12], показало различия как между линиями АТ и донорами, так и между линиями пациентов. различие по показателям фокусов в линиях с известными мутациями AT11SP и AT13SP коррелировало с тяжестью заболевания. Полученные данные позволяют предполагать, что степень тяжести заболевания АТ может зависеть от типа мутаций. В отличие от нашей предыдущей работы, выполненной на дермальных фибробластах пациента с тяжёлой формой АТ, не способных элиминировать фокусы pATMSer1981 [19], по показателю среднего значения количества фокусов p53BP1 через 1 сут. после облучения, достоверных различий между донорами и линиями АТ обнаружено не было. Возможно, это связано с тем, что нарушение способности киназы АТМ образовывать активную форму у пациентов с АТ было выявлено не во всех клетках, и, вероятно, такая мозаичность компенсировала нарушения репарации ДНК в доле «здоровых» клеток, влияя на общую картину. Наши результаты по исследованию способностей репарации ДНК у пациентов с АТ подтверждают поли-морфность заболевания. При развитии организма во время мейоза образуются многочисленные разрывы ДНК, поскольку их восстановление посредством гомологичной рекомбинации помогает создавать физические связи между гомологичными хромосомами, необходимыми для правильной сегрегации хромосом. Несмотря на то, что обычно это очень точный процесс, из-за формирования двунитевых разрывов ДНК в таком масштабе возможны геномные перестройки в зародышевой линии: делеции, дублирования, инверсии и транслокации, приводящие к нестабильности генома [20]. У пациентов с АТ мозаичная форма проявления нарушения работы киназы АТМ, скорее всего, является Полученные результаты дают право говорить о преимуществе нашего подхода диагностики АТ - детального анализа клеточной линии - перед тактикой, принятой в некоторых медицинских зарубежных центрах, основанной на визуализации активной формы киназы АТМ - фосфо-АТМ^1981 при помощи вестерн-блота (https:// primaryimmune.org/about-primary-immunodeficiencies/ specific-disease-types/ataxia-telangiectasia). Благодаря такому подходу нам удалось описать степень мозаичности нарушения функционирования активной формы киназы АТМ в некоторых клеточных линиях, полученных из биоптатов кожи пациентов с АТ, после облучения клеток, что позволяет рекомендовать метод анализа репарационных возможностей ДНК на клеточных линиях дермальных фибробластов при диагностике АТ.

About the authors

M. L Kuranova

Institute of Cytology of the Russian Academy of Science

Email: miryakuranova@gmail.com

A. V Nozdracheva

Peter the Great Saint Petersburg Polytechnic University

R. E Ushakov

Peter the Great Saint Petersburg Polytechnic University

T. A Ledashcheva

Diagnostic Center (Medical Genetic)

L. M Schugareva

City Children's Hospital № 1

E. A Maklanova

Children's Clinical Hospital (CCH)

Yu. N Manenok

Children's Clinical Hospital (CCH)

A. A Vasilishina

Institute of Cytology of the Russian Academy of Science

N. M Pleskach

Institute of Cytology of the Russian Academy of Science

I. M Spivak

Saint Petersburg State University

V. M Mikchelson

Institute of Cytology of the Russian Academy of Science

References

Supplementary files