Therapeutic effects of intra-arterial administration of glial progenitor cells-conditioned medium in acute experimental ishemic stroke in rats

Full Text

Введение Ишемический инсульт - значимая медицинская и социальная проблема во всем мире. Необходимо констатировать, что единственными результативными методами лечения в острый период заболевания являются тромбо-лизис и тромбоэкстракция [1]. тем не менее, данные подходы к терапии не показаны для восстановления утраченных функций головного мозга. В связи с этим поиск новых методов реабилитации больных с ишемическим инсультом остается актуальной медицинской задачей [2]. За последнее десятилетие в ряде исследований были продемонстрированы преимущественно положительные эффекты трансплантации нескольких типов стволовых клеток на моделях экспериментального инсульта in vivo и в клинических испытаниях [3]. технология получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПск) открывает перспективы в области персонализированной терапии, включая возможность получения нейрональных и глиальных клеток-предшественниц человека в неограниченных количествах и минуя этические проблемы [4-6]. Терапия на основе кондиционированных сред (КС) - новый перспективный подход, способный обойти ряд технических, клинических и этических ограничений при прямой трансплантации стволовых клеток [7]. В настоящее время большинство исследователей изучают свойства КС, полученных при культивировании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Однако уже есть работы по применению КС, содержащих продукты секреции и других типов клеток. В частности, перспективным вариантом может быть КС, полученная при культивировании глиальных клеток, поскольку именно данный тип клеток защищает и поддерживает нейроны, секретируя широкий спектр биологически активных факторов [8]. Эксперименты in vitro показали нейропро-тективное действие КС глиальных клеток на нейроны [9]. Нами не было найдено исследований, посвященных изучению влияния КС глиальных клеток на течение экспериментального ишемического инсульта. Целью данной работы является изучение терапевтической эффективности внутриартериального введения КС, полученной при культивировании глиальных клеток-предшественниц (КС-ГКП), на модели окклюзии средней мозговой артерии у крыс (ОСМА). Материал и методы Дизайн исследования Эксперимент выполнен на половозрелых самцах крыс линии Вистар массой 250-300 г (n=31) (AlCondi Ltd., Россия). Все манипуляции с животными были одобрены этическим комитетом Научно-исследовательского института морфологии человека (протокол № 20 от 12.02.20l9) и проведены в соответствии с директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза. Через 24 ч. после ОСМА крысы были случайным образом разделены на 2 экспериментальные группы: группа 1 - контрольная группа с внутриартериальным (ВА) введением 1 мл DMEM/ F12 (Панэко, Россия) (n=19), группа 2 - опытная группа с ВА введением 1 мл КС-ГКП (n=12). Оценку массы тела, неврологического дефицита, объема очага инфаркта мозга производили на следующий день после ОСМА, а также через 7, 14 и 30 сут. после введения сред. Через 30 сут. после инъекций животных выводили из эксперимента путем внутрибрюшинного введения летальной дозы хлоралгидрата (Sigma-Aldrich, США). На фронтальных срезах участков ишемически поврежденной ткани мозга анализировали экспрессию генов маркеров апоптоза, нейритогенеза и воспаления с помощью ПЦР в режиме реального времени. Получение кондиционированных сред на основе глиальных клеток-предшественников ИПСК, полученные из дермальных фибробластов человека с применением набора для репрограммирования CTS CytoTune-IPS 2.1 Sendai (Invitrogen, США), были дифференцированы в глиальные клетки-предшественницы (ГКП), согласно ранее опубликованному протоколу [10]. На первом этапе дифференцировки ИПСК культивировали в среде DMEM/F12 (Панэко, Россия), в которую добавляли малые молекулы-ингибиторы TGFb и BMP сигнальных путей - SB431542 (Stemcell Technologies, США), дорсоморфин (Stemcell Technologies, США) и LDN193189 (Sigma-Aldrich, США), до образования нейральных стволовых клеток (НСК). На следующем этапе НСК инкубировали в среде с факторами роста EGF, FGF-2 (ProSpec, Великобритания) и CNTF (PeproTech, США) для формирования глиального фенотипа. Для получения КС-ГКП клетки дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором и культивировали в среде DMEM/F12 (Панэко, Россия) в течение 12 ч. Далее КС-ГКП центрифугировали при 3000 об/ мин. в течение 5 мин., супернатант собирали и пропускали через 0,22-мм фильтр, затем немедленно замораживали и хранили при температуре -20 °С в течение 1 недели. Для внутриартериального введения КС-ГПК готовили раствор, содержащий 50 мкг общего белка в 1 мл среды. Количественное определение белка Определение концентрации белка проводили по методу Бредфорда [11]: к 160 мкл раствора белка добавляли 40 мкл 0,03% раствора кумасси G-250 (BioRad, США), инкубировали 5-10 мин. при 20 С и измеряли оптическую плотность при 595 нм на планшетном ридере (PerkinElmer, США). Концентрацию белка определяли по калибровочной кривой, для построения которой использовали растворы 0-250 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (Панэко, Россия). Иммуноцитохимический анализ Для подтверждения фенотипа полученной культуры ГКП было проведено иммуноцитохимическое окрашивание на глиальные маркеры. Клетки фиксировали 4% раствором формальдегида (Merck, Германия) в течение 10 мин., пермеабилизовали 0,25% раствором Тритона Х-100 (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 мин. и обрабатывали первичными антителами к глиальному маркеру S100b и фиброзному астроцитарному маркеру CD44 в течение ночи при +4 °C: анти^100Ь (1:300; Abcam ab52642, США) и анти^44 (1:400; Abcam ab6124, США). Затем клетки промывали фосфатно-солевым буфером и инкубировали с вторичными антителами, меченными флуорохромом Alexa Fluor 555 goat anti-mouse (1:600; Invitrogen, США) и Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit (1:600; Invitrogen, США) в темноте в течение 60 мин. Ядра клеток докрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI (4,6-диамино-2-фенилиндолдигидрохлорида) (Sigma-Aldrich, США). Моделирование экспериментального инфаркта мозга транзиторную окклюзию правой средней мозговой артерии выполняли по методу Коидзуми [1 1] Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 82 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ в модификации Лонга [12] и с дополнительным интра-операционным Мрт-контролем, как было описано нами ранее [13]. операцию проводили под ингаляционной анестезией 2,5-3% изофлураном (Minrad, США] со смесью атмосферного воздуха (97-97,5%]. Окклюзию правой средней мозговой артерии производили монофиламен-том 4-0, покрытым силиконовым наконечником (диаметр 0,19 мм, длина 30 мм; диаметр покрытия 0,37±0,02 мм; длина покрытия 3-4 мм; корпорация Doccol, США] в течение 90 мин., после чего филамент извлекали с целью реперфузии. Во время операции и до полного выхода из наркоза температуру животных поддерживали на уровне 37 °С с помощью грелки. Внутриартериальное введение КС-ГКП Под ингаляционной анестезией изофлураном операционную рану вскрывали, через культю наружной сонной артерии вводили полиуретановый микрокатетер (наружный диаметр 0,635 мм, внутренний диаметр 0,305 мм; корпорация Doccol, США] во внутреннюю сонную артерию с поддержанием кровотока, катетер подсоединяли к шприцу объемом 1 мл, помещенному в микроинъектор, и вводили 1 мл КС-ГКП или DMEM/F12 со скоростью 100 мкл/мин. Магнитно-резонансная томография Магнитно-резонансную томографию (МРТ) выполняли с использованием экспериментального МРТ томографа для малых лабораторных животных с индукцией магнитного поля 7 Тл ClinScan (Bruker BioSpin, США]. МРТ-диагностику ОСМА для контроля положения филамента, кровотока в интракраниальных сосудах и геморрагического осложнения проводили, как описано ранее [13]. Объем инфаркта мозга оценивали с помощью программного пакета ImageJ (Национальный институт психического здоровья, США] по данным Т2-взвешенных изображений (Т2-ВИ] путем суммирования объемов, измеренных в соседних поперечных сечениях по следующей формуле: V=(S1+...+Sn]x(h+d], где S1.....Sn - площадь, измеренная на срезе n, h - толщина среза, d - интервал между срезами. Оценка терапевтических эффектов Терапевтические эффекты определяли по показателям выживаемости, массы тела и баллу по модифицированной шкале оценки тяжести инсульта для грызунов (mNSS] до введения и далее через 7, 14 и 30 сут. после инфузии КС-ГКП. Степень выраженности неврологического дефицита оценивали по двигательной и сенсорной функциям, рефлексам и способности держать равновесие [14]. ПЦР-анализ При исследовании экспрессии генов в тканях головного мозга крыс через 30 сут. эксперимента готовили фронтальные срезы из области повреждения и обрабатывали их реагентом RNAlater (Invitrogen, США] для стабилизации РНК в тканях. Из полученных образцов ткани выделяли мРНК с помощью коммерческого набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, США] в соответствии с прилагаемыми инструкциями. кДНК синтезировали по стандартному протоколу Fermentas kit (Thermo Fisher Scientific, США]. Для ПЦР в режиме реального времени использовали готовую реакционную смесь с интеркали-рующим красителем qPCRmix-HS SYBR (Evrogen, Россия], амплификацию проводили с помощью термоциклера BioRad iQ cycler (BioRad, США]. Параметры реакции: первичная денатурация 95 °C, 5 мин.; денатурация 95 °C, 20 сек.; отжиг праймера 55-63 °C, 20 сек.; удлинение 72 °C, 20 сек. (40 циклов]. Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к усредненным данным амплификации гена домашнего хозяйства GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа]. Праймеры для ПЦР: GAP43, forward AAGGATGATGCTCCCGTTGC, reverse CGGCCTTTTCCTCTGAAGGG; BAX forward TTGTG-GCTGGAGTCCTCACT; reverse TTTCCCCCCCCCCATTCATC; BCL-2 forward GGGGCTACGAGTGGGATACT, reverse G ACGGTAGCG ACG AG AG A AG; TNFa forward CCACCAC-GCTCTTCTGTCTA, reverse GCTACGGGCTTGTCACTCG; GAPDH forward GCGAGATCCCGCTAACATCA, reverse GCTACGGGCTTGTCACTCG. Относительное количество мРНК было рассчитано методом 2-AAC(T]. Статистический анализ Статистическую обработку данных выполняли в программе SigmaPlot 12.5 (Национальный институт психического здоровья, США]. Сравнение данных при нормальном распределении проводили с помощью t-теста, при распределении, отличном от нормального - с помощью U-критерия Манна-Уитни. Для оценки кривой выживаемости использовали метод Каплана-Мейера с сопоставлением двух групп. Различия считали достоверными при p<0,05. Результаты Характеристика ГКП, полученных из ИПСК После дифференцировки ГКП имели веретенообразную или уплощенную морфологию с тонкими, умеренно разветвленными отростками (рис. 1А]. ГКП были имму-нопозитивны к глиальному маркеру S100b и маркеру фиброзных астроцитов CD44 (рис. 1Б, В] [15]. Доля S100b+-клеток в культуре составила 97±3%. Выживаемость животных Кривые выживаемости Каплана-Мейера для сравниваемых групп представлены на рис. 2А. Животные обеих групп погибали в основном в течение первых 3 сут. после ОСМА из-за вазогенного отека вещества мозга, характерного для острейшего периода ишемического инсульта, достоверных различий между двумя группами выявлено не было. Таким образом, введение КС-ГКП не оказывало значимого влияния на выживаемость животных. Масса тела Терапия КС-ГКП не оказывала значимого влияния на динамику изменения массы тела: в обеих группах масса тела животных снижалась в течение первых 7 сут. после ОСМА, достоверных различий между двумя экспериментальными группами не было (рис. 2Б]. Неврологический дефицит Животных обеих групп тестировали по шкале mNSS для оценки степени неврологического дефицита перед введением КС-ГКП и далее через 7, 14, 30 сут. Было обнаружено, что терапия КС-ГКП значимо улучшала функциональное восстановление животных в остром периоде экспериментального ишемического инсульта: Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 83 Рис. 1. Глиальные клетки-предшественницы, полученные из ИПСК: А - морфология клеток в культуре; Б, В - экспрессия культурой глиального маркера S100b (Б, зеленый цвет) и фиброзного астроцитарного маркера CD44 (В, красный цвет). А - фазово-контрастная микроскопия, Б, В - иммуноцитохимическая реакция с антителами к соответствующим маркерам, ядра клеток докрашены DAPI, флуоресцентная микроскопия. Масштабный отрезок: А - 1000 мкм, Б, В - 100 мкм. А Б В Рис. 2. Динамика выживаемости, изменения массы тела и объема очага повреждения после ОСМА у животных с введением КС-ГКП или DMEM/F12 (контроль): А - кривые выживаемости Каплана-Мейера в группах контроля и КС-ГКП; Б - динамика изменения массы тела животных, нормированная по отношению к 1 сут.; В - динамика изменения степени неврологического дефицита, нормированная по отношению к 1 сут. *разница с контрольной группой статистически значима, р<0,05 0 5 15 АБ Рис. 3. Объем очага инфаркта (А) и МРТ-изображения (Б) головного мозга крыс обеих групп. Динамика нормированного объема очага инфаркта по отношению к 1 сут. день 1 день 7 - день 14 день 30 балл по шкале mNSS был достоверно ниже в группе с введением КС-ГКП по сравнению с контрольной группой через 14 и 30 сут. (p<0,05) (рис. 2В). Объем очага инфаркта При сравнении объемов зон инфаркта мозга, посчитанных с использованием Т2-взвешенных МРТ-изображений в динамике, статистически значимых различий между двумя группами обнаружено не было (рис. 3). Изменение профиля экспрессии генов в тканях в области повреждения После введения КС-ГКП уровень экспрессии гена позитивного регулятора апоптоза bax статистически значимо снижался по сравнению с контрольной группой. Достоверных различий в экспрессии гена bcl2 между группами сравнения обнаружено не было (рис. 4). Введение КС-ГКП статистически достоверно снижало экспрессию гена tnfa в паренхиме головного мозга и повышало экспрессию маркера нейритогенеза gap43 по сравнению с контрольной группой (рис. 4). Обсуждение Роль веществ, секретируемых глиальными клетками, в восстановлении функциональной активности крыс после ишемического инсульта изучена нами впервые. Проведенное исследование показало, что терапия КС-ГКП приводила к более выраженному регрессу неврологической симптоматики у животных после Гены & Клетки, том XV, № 3, 2020 84 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 14-| 0 12- 1 0 § 10- О 0 0 1 8- СП ! 6 -_D С 0 Ё 4 -о ^ 0 1 ё 2 -0gap43 bcl2 bax tnfa Рис. 4. Относительная экспрессия генов маркеров апоптоза, нейритогенеза и воспаления. ПЦР в режиме реального времени. *разница с контрольной группой статистически значима, р<0,05 инсульта по сравнению с контрольной группой. Однако мы не наблюдали значимого уменьшения объема очага инфаркта мозга или улучшения выживаемости животных в ответ на введение КС-ГКП. Для поиска молекулярно-генетических механизмов терапевтического воздействия КС-ГКП была изучена экспрессия генов маркеров апоптоза, нейритогенеза и воспаления с помощью ПЦР-анализа. Известно, что сосудистый некроз головного мозга вызывает вторичное, зачастую отсроченное поражение тканей за счет продолжающегося воспаления. Данная реакция сопровождается выработкой провоспалительных цитокинов и факторов роста. Повышенная экспрессия гена tnfa усиливает выраженность поражений при очаговой церебральной ишемии [16]. Нами было обнаружено, что уровни экспрессии генов позитивного регулятора апоптоза bax и провоспалительного цитокина tnfa снижались, в то время как уровень экспрессии маркера нейритогенеза gap43 повышался в веществе головного мозга после введения КС-ГКП. Полученные результаты частично согласуются с ранее опубликованными работами, в которых доказана эффективность КС в моделях in vivo: при введении КС нейральных стволовых клеток крысам с ишемическим инсультом показатели неврологического дефицита и объема очага инфаркта были ниже, чем в группе контроля [17]. Внутривенное введение КС мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в модели инсульта у крыс значительно улучшало функциональное восстановление и ослабляло инфильтрацию микроглии и макрофагов в головном мозге, уменьшая экспрессию гена tnfa [18]. Кроме того, была продемонстрирована способность нейральных стволовых клеток в модели ОСМА оказывать противовоспалительное действие посредством секреции цитокинов и хемокинов [19, 20]. Представленные данные свидетельствуют о том, что внутриартериальное введение КС, полученной от дифференцированных в глиальном направлении ИПСК, улучшает функциональное восстановление животных после экспериментального инсульта и может влиять на пластичность мозга. Результаты исследования говорят о перспективности использования и необходимости дальнейшего изучения КС-ГКП для терапии заболеваний центральной нервной системы.

About the authors

E. A Cherkashova

Federal Center for brain and neurotechnology of the Federal medical and biological agency

D. I Salikhova

Research Centre for Medical Genetics; Research Institute of Human Morphology

D. D Namestnikova

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

G. E Leonov

Research Centre for Medical Genetics

I. L Gubskiy

Federal Center for brain and neurotechnology of the Federal medical and biological agency

A. A Solovieva

Federal Center for brain and neurotechnology of the Federal medical and biological agency

G. B Akopyan

Federal Center for brain and neurotechnology of the Federal medical and biological agency

V. V Kurilo

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

M. P Nikitina

Research Institute of Human Morphology

T. Kh Fatkhudinov

Research Institute of Human Morphology; Peoples' Friendship University of Russia

V. P Chekhonin

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

L. V Gubskiy

Federal Center for brain and neurotechnology of the Federal medical and biological agency; N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

K. N Yarygin

V.N. Orehovich Institute of Biomedical Chemistry; Russian Medical Academy of Continuous Professional Education

T. B Bukharova

Research Centre for Medical Genetics

D. V Goldshtein

Research Centre for Medical Genetics; Peoples' Friendship University of Russia

References

Supplementary files