Stimulation of neurogenesis at hippocampus in Alzheimer's disease

Full Text

Введение Болезнь Альцгеймера - хроническое нейроде-генеративное заболевание, характеризующееся развитием деменции и выраженными патоморфологическими изменениями в гиппокампе и коре головного мозга. Начинаясь с когнитивных нарушений (в первую очередь - с нарушений памяти), болезнь Альцгеймера постепенно охватывает все сферы жизнедеятельности человека и становится причиной инвалидности Смерть наступает в среднем через 8 лет после постановки диагноза В настоящее время накоплен значительный опыт применения лекарственных средств при болезни Альцгеймера, но, к сожалению, до сих пор медицина не располагает эффективными средствами для ее лечения В связи с этим, необходима разработка новых, эффективных подходов для лечения данной патологии, основанных на детальных сведениях о молекулярных механизмах патогенеза заболевания. Одним из перспективных направлений в разработке подходов к лечению болезни Альцгеймера является использование генно-клеточных технологий, в частности - трансплантация мононуклеарных клеток пуповинной крови человека (МКПК), трансдуци-рованных аденовирусными векторами, кодирующими трофические и ростовые факторы. Доставка с помощью МКПК генов естественных ростовых и трофических факторов в область дегенерации способствует выживанию нейронов, росту аксонов, процессам синаптогенеза и нейрогенеза, а, следовательно, улучшает высшие нервные функции Нейрогенез во взрослом мозге - это явление, относительно недавно признанное научным сообществом, которое опровергло существовавшую долгое время научную теорию о статичности нервной системы и её неспособности к клеточной регенерации Сейчас общепризнанным является тот факт, что нейрогенез постоянно происходит в двух ограниченных областях мозга - в субгранулярной зоне (СГЗ) гиппокампа и субвентрикулярной зоне (СВЗ) боковых желудочков Новые нейроны, образующиеся в СГЗ, мигрируют в слой гранулярных клеток зубчатой извилины гиппокампа [1]. Нейроны, образующиеся в СВЗ, поступают в ассоциативную новую кору, эн-торинальную кору и обонятельные луковицы [2, 3] Недавние исследования показали, что вновь образовавшиеся нейроны во взрослом мозге встраиваются в существующие нейронные сети и получают функциональные входы [4] Нейрогенез во взрослом мозге регулируется физиологическими и патологи Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 55 ческими факторами на всех уровнях, а новые нейроны могут быть необходимы для определенных функций мозга, например, обучения и памяти. При болезни Альцгеймера наблюдается дизрегуляция нейрогенеза. У трансгенных мышей с моделью болезни Альцгеймера на ранних стадиях наблюдается усиленная пролиферация и дифференцировка нейронов, тогда как на поздних стадиях нейродегенерации в разных исследованиях получены данные как об усилении, так и об угнетении данных процессов [5]. В настоящей работе мы провели оценку процессов нейрогенеза в модели болезни Альцгеймера на мышах после трансплантации генетически модифицированных МКПК человека. Материал и методы Создание генно-клеточных конструкций. Заготовку пуповинной крови человека проводили после получения информированного согласия у беременной и дородового скрининга на наличие противопоказаний к донорству пуповинных клеток. Кровь собирали в пластиковые контейнеры CPDA-1 250 GG (Terumo) и доставляли в Банк стволовых клеток казанского государственного медицинского университета, где из неё выделяли мононуклеарную фракцию с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла [6]. Полученные клетки ресуспензировали в среде DMEM, к которой были добавлены сыворотка крови плодов коровы (10%), L-глутамин (2 мМ), смесь антибиотиков пенициллина и стрептомицина (1%) (Sigma, США). Для генетической модификации клетки трансдуцировали рекомбинантными аденовирусами, экспрессирующими ген EGFP или GDNF (10 бляшко-образующих единиц на клетку). Моно-нуклеарные клетки пуповинной крови (МКПК) культивировали 14-16 ч. в 10 см культуральных чашках при 37°С в условиях термостатирования с поддержанием 5% уровня СО2 во влажной атмосфере Перед трансплантацией МКПК осаждали центрифугированием и разводили в стерильном физиологическом растворе до концентрации 2х106 кл./мл. Методика получения указанных генетически модифицированных МКПК была более подробно описана ранее [7, 8]. Ксенотрансплантация клеток. Ксенотранспланта-ция генетически модифицированных клеток экспериментальным животным осуществлялась однократно в количестве 2 млн в ретроорбитальный венозный синус Экспериментальные группы животных. В качестве модели болезни Альцгеймера использовалась генетическая модель болезни Альцгеймера у мышей с генотипом В6СЗ-Tg(APP695)85Dbo Tg(PSENI)85Dbo. Были сформированы следующие экспериментальные группы: трансгенные мыши после трансплантации МКПК человека, экспрессирующих репортерный зеленый флуоресцирующий белок EGFP (группа Alz-EGFP), трансгенные мыши после трансплантации МКПК человека, экспрессирующих молекулы глиального нейротрофического фактора (группа Alz-GDNF), трансгенные мыши и мыши дикого типа, не подвергавшиеся трансплантации (группы Alz и WT, соответственно). Иммунофлуоресцентное окрашивание. Для оценки процессов нейрогенеза исследовали характер и интенсивность экспрессии маркеров нейрональных стволовых и прогениторных клеток (нестин, даблкор-тин) в гиппокампе мышей с моделью БА на девятые сутки после трансплантации МКПК, экспрессирующих EGFP и GDNF. Нестин - белок промежуточных филаментов, маркер прогениторных клеток, находящихся на стадии пролиферации. Даблкортин - ассоциированный с микротрубочками белок, экспрессирующийся в мигрирующих и дифференцирующихся нейронах [4]. Анестезированных мышей транскардиально пер-фузировали сначала фосфатно-солевым буферов (PBS), затем 4% раствором параформальдегида. После этого извлекали головной мозг и фиксировали в растворе параформальдегида в течение суток, далее перекладывали в 30% раствор сахарозы на PBS с добавлением азида натрия (0,02%) Для приготовления криостатных срезов ткань помещали в заливочную среду Neg 50 и замораживали в течение 2 мин Приготовленные срезы помещали в PBS, промывали в 0,1% растворе Triton-X100 на PBS (PBST), инкубировали в 5% растворе ослиной сыворотки в PBST в течение 45 мин при комнатной температуре Для оценки процессов нейрорегенерации срезы инкубировали с антителами к даблкорти-ну (Doublecortin, Abcam, Англия, 1:200) и нестину (Nestin, Millipore, США) в течение 2 сут. при 4°С, промывали в PBS, затем инкубировали со вторичными антителами осла, коньюгированными с флуоресцентным красителем anti-rabbit Alexa 647 и anti-mouse Alexa 555 в течение 2 ч. при комнатной температуре в темноте, промывали в PBS Для визуализации ядер срезы дополнительно окрашивали раствором 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 10 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, Sigma, США) далее промывали в PBS Окрашенные срезы заключали в среду Shandon Immu-Mount и изучали при помощи конфокального сканирующего микроскопа LSM 510-Meta (Carl Zeiss, Германия). Исследовали следующие области гиппокампа: CA1, CA3, зубчатая извилина. Интенсивность свечения даблкортина и нестина анализировали при помощи программы ZEN 2012. Значение интенсивности выражали в условных единицах, которые рассчитывали как соотношение флюоресцирующих точек (пикселей) в пределах данного участка к несветящимся (шкала от 0 до 256). Результаты морфометрии обрабатывали с использованием дисперсионного анализа ANOVA, отличия считались достоверными при P<0,05. Результаты Иммуноэкспрессия нестина в зубчатой извилине. В зубчатой извилине гиппокампа мышей с моделью БА средняя плотность свечения нестина была достоверно ниже, чем у мышей дикого типа того же возраста (рис. 1А). Иммунореактивные к нестину области в группе «WT» были наиболее сконцентрированы в субгранулярной зоне и хилусе зубчатой извилины В группе мышей с моделью БА единичные нестин-позитивные (Nestin + ) клетки располагались во всех слоях зубчатой извилины В гиппокампе по распределению иммунореактивности к нестину нами выделено 2 вида Nestin+ клеток: 1) тело клетки крупное (диаметр «10 мкм) с ветвистыми нестин-позитивными отростками; 2) небольшие клетки (диаметр <5 мкм), в которых иммуноэкспрессия не-стина наблюдалась лишь в телах В зубчатой извилине гиппокампа мышей группы «WT» клетки первого вида были широко распространены, а клетки второго вида встречались редко. В группе «Alz» картина была Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 56 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ обратная, за исключением, хилуса, где одинаково обнаруживались оба вида клеток (рис. 2). В зубчатой извилине гиппокампа мышей группы «Alz-EGFP» средняя плотность свечения нестина была достоверно больше, чем в группе «Alz». Уровень иммуноэкспрессии нестина в группе «Alz-GDNF» не отличался от показателей группы «Alz» (рис. 1А). После трансплантации МкПк, экспрессирующих как EGFP, так и GDNF, в субгранулярной зоне локализовались преимущественно крупные нестин-позитивные клетки со слабо окрашенными отростками, а в хилусе зубчатой извилины находились оба вида нестин-по-зитивных клеток: крупные ветвистые и небольшие по размерам клетки без отростков (рис 2) Иммуноэкспрессия даблкортина в зубчатой извилине. Средняя плотность свечения даблкортина в группе «Alz» была ниже, чем в группе «WT», но отличия не являлись статистически достоверными (см. рис. 1Б). Было идентифицировано 2 вида даблкортин-позитивных (DCX+) нейробластов с диаметром 10±2 мкм: 1) иммунореактивные области к даблкортину равномерно распределялись по телу клетки, но не распространялась на отростки; 2) им-мунореактивные области распределялись по периферии тел клеток и распространялась на отростки У мышей дикого типа отмечено большое количество DCX+ клеток, в которых иммунореактивность равномерно распределялась по всей соме, но не распространялась на отростки. Локализованы эти клетки были преимущественно в гранулярной и субграну-лярной зонах клетки, в которых иммунореактивные области к даблкортину распределялась по периферии тел и распространялась на отростки, встречались преимущественно в хилусе и молекулярном слое зубчатой извилины В зубчатой извилине гиппокампа мышей группы «Alz» DCX+ клеток первого вида либо не было, либо они встречались редко, а второй вид клеток был распространен повсеместно, при этом небольшое количество из них находилось в гранулярной зоне (рис. 3). Средняя плотность свечения даблкортина достоверно увеличивалась в группах «Alz-EGFP» и «Alz-GDNF» по сравнению с показателями мышей с моделью болезни Альцгеймера, не получивших лечения (рис. 1Б). В группах «Alz-EGFP» и «Alz-GDNF» в субгранулярной зоне гиппокампа располагались даблкортин-позитивные клетки обоих видов. DCX+ клетки второго вида в небольшом количестве были интегрированы в гранулярную зону, а основная их часть находилась в молекулярном слое и хилусе зубчатой извилины (рис 3) Иммунокспрессия нестина в CA1 зоне гиппокампа. Средняя плотность свечения нестина не различалась у мышей с моделью БА и мышей дикого типа (рис. 1А). В CA1 зоне гиппокампа обеих групп были отмечены оба вида нестин-позитивных клеток, интегрированных в пирамидный слой и расположившихся в молекулярном слое. На 9 сут. после трансплантации МкПк человека, экспрессирующих как EGFP, так и GDNF, отличий в средней плотности свечения нестина, а также в типе и локализации нестин-позитивных клеток от группы «Alz» не было (см. рис. 1А). Здесь также встречались преимущественно небольшие по размерам Nestin + клетки без отростков, не имеющие конкретных мест локализации Иммуноэкспрессия даблкортина в CA1 зоне гиппокампа. Средняя плотность свечения даблкортина в группе «Alz» была ниже, чем в группе «WT», но отличия не являлись достоверными (рис. 1Б). В группе «WT» DCX+ клетки обоих видов были распределены повсеместно в пределах поля зрения, в том числе интегрированы в пирамидный слой клеток. В группе «Alz» DCX+ второго вида были расположены преимущественно в молекулярном слое CA1 зоны гиппокампа А Нестин Б Даблкортин Рис. 1. Уровни иммуноэкспрессии нестина и даблкортина в различных областях гиппокампа: А - средняя плотность свечения нестина в зубчатой извилине (DG), CA1 и CA3 зонах гиппокампа мышей; Б - средняя плотность свечения даблкортина в DG, CA1 и CA3 зонах гиппокампа мышей тех же групп. WT - мыши дикого типа; Alz - мыши с моделью болезни Альцгеймера; Alz-EGFP - мыши с моделью болезни Альцгеймера после трансплантации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующих репортерный зеленый флуоресцирующий белок EGFP; Alz-GDNF - мыши с моделью болезни Альцгеймера после трансплантации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующих глиальный нейротрофический фактор GDNF. * - статистически достоверное отличие по критерию ANOVA (P<0,05) Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 Merge DCX DAPI Merge Nestin DAPI оригинальные исследования 57 WT Alz Alz-EGFP Alz-GDNF Рис. 2. Иммуноэкспресссия нестина (красный цвет) в зубчатой извилине гиппокампа: WT - мыши дикого типа; Alz - мыши с моделью болезни Альцгеймера; Alz-EGFP - мыши с моделью болезни Альцгеймера после трансплантации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующих репортерный зеленый флуоресцирующий белок EGFP; Alz-GDNF - мыши с моделью болезни Альцгеймера после трансплантации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующих глиальный нейротрофический фактор GDNF. Докраска ядер - DAPI. Merge - совмещение двух верхних панелей. Масштабный отрезок - 20 мкм WT Alz Alz-EGFP Alz-GDNF Рис. 3. Иммуноэкспресссия даблкортина (желтый цвет) в зубчатой извилине гиппокампа: WT - мыши дикого типа; Alz - мыши с моделью болезни Альцгеймера; Alz-EGFP - мыши с моделью болезни Альцгеймера после трансплантации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующих репортерный зеленый флуоресцирующий белок EGFP; Alz-GDNF - мыши с моделью болезни Альцгеймера после трансплантации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, сверхэкспрессирующих глиальный нейротрофический фактор GDNF. Докраска ядер - DAPI. Merge - совмещение двух верхних панелей. Масштабный отрезок - 20 мкм Гены & клетки Том X, № 4, 2015 58 оригинальные исследования Средняя плотность свечения даблкортина достоверно увеличивалась в группе «Alz-EGFP» по сравнению с группой «Alz». В группе мышей с моделью БА после трансплантации МКПК, экспрессирующих GDNF, средняя плотность свечения даблкортина также увеличивалась, по отношению к показателям таких же мышей, не получивших лечения, но отличия были статистически недостоверными (рис. 1Б). В группе «Alz-GDNF», как и в группе «Alz», были обнаружены DCX+ клетки второго вида, распределенные преимущественно в молекулярном слое В группе «Alz-EGFP» отмечены даблкортин-позитивные клетки обоих видов Иммуноэкспрессия нестина в CA3 зоне гиппокампа. Средняя плотность свечения нестина имела тенденцию к снижению в группе «Alz» в сравнении с «WT» (рис. 1А). В CA3 области гиппокампа здоровых мышей и мышей с моделью БА присутствовали оба вида нестин-позитивных клеток, которые располагались и в молекулярном, и пирамидном слоях. Средняя плотность свечения нестина в CA3 зоне гиппокампа групп «Alz-EGFP» и «Alz-GDNF» была выше, чем в гиппокампе мышей с моделью болезни Альцгеймера, не получивших лечения, но статистически отличия не являлись достоверными (см рис 1А). По морфологии и локализации нестин-позитив-ные клетки были такие же, как в группах «Alz» и WT - преимущественно небольшие клетки без отростков, расположившиеся в молекулярном и пирамидном слоях Иммунокспрессия даблкортина в CA3 зоне гиппокампа. Средняя плотность свечения даблкор-тина была недостоверно снижена в группе «Alz» в сравнении с показателями мышей дикого типа (рис. 1Б). В группе «WT» присутствовали DCX+ клетки обоих видов, тогда как в группе «Alz» обнаруживались преимущественно DCX+ второго вида. Средняя плотность свечения даблкортина в группах «Alz-EGFP» и «Alz-GDNF» достоверно не отличалась от показателей мышей с моделью БА, не получивших лечения (рис. 1Б). Как и в группе «Alz» здесь обнаруживались преимущественно DCX+ второго вида. Обсуждение На начальных стадиях БА происходит активация нейрорегенерации, но по мере развития заболевания нейрогенез нарушается Уровень нейрорегенерации регулируется рядом экзогенных и эндогенных факторов Как известно, БА характеризуется наличием амилоидных бляшек в тканях мозга и нейрофибрил-лярных клубков, нагруженных тау-белком, внутри нервных клеток Данные протеинопатии сопровождаются воспалительными реакциями и массивной потерей нейронов и синапсов Соответственно, при БА пагубно влиять на регенерацию могут воспалительные реакции, возникающие в ответ на накопление ß-амилоида. Провоспалительные цитокины IL-1, IL-6 и фактор некроза опухоли тормозят нейрогенез и пролиферацию клеток гиппокампа [9]. Кроме того, число новообразующихся нейронов снижается при нарушении холинергической иннервации: иммунохи-мическое повреждение холинергических нервов приводит к снижению числа клеток, меченых по BrdU, в зубчатой извилине гиппокампа и ольфакторной области При этом усиление холинергической нейротрансмиссии способствует образованию новых нейронов [10]. Проведенное нами исследование показало, что у мышей с генетической моделью болезни Альцгеймера снижена экспрессия нестина и даблкортина в гиппокампе, что свидетельствует о нарушении процессов нейрогенеза. В норме у взрослых млекопитающих нейронные клетки-предшественницы, расположенные в зубчатой извилине, сохраняют свою способность генерировать нейроны и глию на протяжении всей жизни. У грызунов увеличение производства новых гранулярных нейронов ассоциировано с улучшениями памяти, в то время как снижение гиппокампального нейрогенеза приводит к ее нарушениям В мышиных моделях болезни Альцгеймера (в частности, APP/PS1 мышах) нейрогенез замедлен, а образуемые гранулярные нейроны не интегрируются в существующие нейронные сети [11]. Таким образом, активация нейрогенеза должна улучшить функциональную пластичность гиппокампа Трансплантация МКПК, сверхэкспрессирующих как EGFP, так и GDNF оказывала положительное влияние на характер и уровень экспрессии нестина и даблкортина в гиппокампе мышей с моделью болезни Альцгеймера Вероятным этому объяснением является наличие в пуповинной крови стволовых клеток, способных давать начало специализированным клеткам разных тканей, а также являющихся источником многочисленных ростовых и нейротрофиче-ских факторов [12-14]. Ранее нами были получены данные о том, что после инъекции МКПК человека у мышей с моделью БА улучшалась пространственная память [15]. В настоящем исследовании мы установили, что уже на девятые сутки после трансплантации МКПК человека обнаруживаются свидетельства активации нейрогенеза в гиппокампе этих мышей Полученные данные свидетельствуют о высоком терапевтическом потенциале предложенных генно-клеточных конструкций для лечения болезни Альцгеймера, и одним из механизмов их действия, является, очевидно, стимулирование нейрорегенерации

About the authors

E. O Petukhova

Kazan State Medical University

Y. O Mukhamedshina

Kazan State Medical University; Kazan (Volga Region) Federal University

O. Y Vasilieva

Kazan State Medical University; Kazan (Volga Region) Federal University

L. Y Aksenova

Kazan State Medical University; Kazan (Volga Region) Federal University

V. V Solovyeva

Kazan (Volga Region) Federal University

E. E Garanina

Kazan (Volga Region) Federal University

A. A Rizvanov

Kazan (Volga Region) Federal University

A. L Zefirov

Kazan State Medical University

R. R Islamov

Kazan State Medical University

M. A Mukhamedyarov

Kazan State Medical University

Email: maratm80@list.ru

References

Supplementary files