Effect of gelatin cryogel on proliferation and synthetic activity of fibroblasts in excision wound model

Full Text

Введение Разработка высокоэффективных биоматериалов для лечения ран и ожогов является актуальной задачей для современной медицины и фармацевтики. Несмотря на разнообразие коммерческих ранозаживляющих биоматериалов, последние, по результатам наблюдений практикующих врачей, включая авторов, оказывают незначительное позитивное влияние на процессы регенерации кожи Для создания тканезамещающих материалов и раневых повязок широко используют полимерные гидрогели благодаря их оптимальным механическим и гидратационным свойствам, биосовместимости [1] и возможности применения для контролируемой доставки биологически активных веществ [2] Значительное внимание исследователей уделено модулированию биологических характеристик гидрогелей путем изменения пористости материала, оказывающей существенное влияние на диффузионные процессы и миграционный потенциал клеток Перспективными являются гидрогели, получаемые e-mail: tabdulli@gmail.com методом криополимеризации различных синтетических и природных молекул - криогели, характеризующиеся разветвленной макропористой структурой [3, 4] Изучение влияния криогелей на процессы заживления кожных ран различной этиологии представляет интерес для выяснения взаимосвязи структуры и активности биоматериалов, что актуально для разработки на их основе эффективных ранозаживляющих средств Первичный скрининг биологической активности гидрогелевых биоматериалов проводят с использованием различных in vitro моделей [5], тогда как для проведения доклинических исследований определяющим является выбор оптимальной in vivo модели [6, 7]. Согласно исследованиям последних лет, для оценки влияния биоматериалов на посттравматиче-скую регенерацию кожи предпочтительны модель разреза (рассечения)[8], эксцизионная [5, 7, 9-12] и ожоговая [6, 13, 14] модели. Тестирование проводят, как правило, на крысах [11, 12, 14] или свиньях Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 30 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ [7, 15]; при этом не разработаны единые регламенты, определяющие методологические условия проведения эксперимента [6, 16]. Важным критерием эффективности ранозаживляющих биоматериалов является восстановление клеточного состава, волокнистого и аморфного компонентов соединительной ткани кожи (дермы) - одной из наиболее пластичных тканей организма [17, 18]. Развитие грануляционной ткани является ключевой фазой раневого процесса, определяющую роль в котором играют дермальные фибробласты, синтезирующие компоненты межклеточного матрикса и участвующие в формировании волокон дермы [13, 18], а также регулирующие миграционную, синтетическую и пролиферативную активности других клеток дермы [5, 12]. Целью настоящей работы была оценка влияния экспериментального образца криогеля желатина на синтетическую активность и пролиферацию фибро-бластов в модели эксцизионной раны кожи крыс. Материал и методы Получение криогеля желатина и исследование in vitro. Бычий желатин (Gelita, Германия) растворяли в деионизованной воде и автоклавировали в стандартных условиях. Мембраны криогеля толщиной 2 мм получали в асептических условиях посредством сшивки желатина глутаровым альдегидом (Acros Organics, США) в чашках Петри в условиях замораживания, как описано в [4]. Криогели размораживали при комнатной температуре и промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (ФСБ). Для культивирования клеток использовали материалы и реагенты компании ПанЭко (Россия) Первичные фибробласты кожи человека (ФКЧ) выделяли из кожных эксплантов здоровых доноров и культивировали в стерильных условиях в питательной среде a-MEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при температуре + 37°C в увлажненной атмосфере 5% CO2 [19]. Мембраны криогеля размером 1x1 см помещали на поверхность предварительно выращенного монослоя ФКЧ в 24-луночном планшете и культивировали в течение 3, 6 и 9 сут. Матриксы с ФКЧ переносили в новые лунки планшета, промывали ФСБ и детектировали клетки с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ) на микроскопе LSM 780 (Carl Zeiss, Германия) в присутствии 1 мкМ Hoescht 33342, а также по уровню активности клеточной лактатдегидрогеназы (ЛДГ), определяемой с помощью набора «ЛДГ (UV-кинетический)» (Ольвекс Диагностикум, Россия). Для определения ЛДГ клетки после культивирования в матриксах ли-зировали в ФСБ, содержащем 1% тритон Х-100 и 1 мМ фторида натрия Активность ЛДГ оценивали по изменению оптического поглощения раствора НАДН при 340 нм за 1 мин., нормализованного по массе матрикса Эксцизионная модель раневого дефекта кожи. Действие криогеля на миграционную, пролиферативную и синтетическую активность фибро-бластов in vivo изучали на эксцизионной модели раневого дефекта кожи на 30 крысах-самцах линии Wistar массой 260-280 г (ООО «Питомник» РАМНТ, Россия). Эксперименты с животными про водили в соответствии с европейскими нормами по защите лабораторных животных [20]. Предоперационную наркотизацию животных проводили изо-флураном (Abbott Laboratories, Великобритания) с помощью испарителя для ингаляционного наркоза IsoFlo (Eickemeyer, Германия), укомплектованного 5-л концентратором кислорода (DeVilbiss, США). На депилированной межлопаточной части тела животных вырезали два симметрично расположенных относительно позвоночника участка кожи диаметром (0) 12 мм. Для предотвращения стягивания раны за счет естественного посттравматического закрывания краев [9] края раны ограничивали силиконовыми шинами (внутренний 0 = 12 мм, внешний 0 = 25 мм, толщина 0,5 мм) и фиксировали скобами с помощью степлера для кожи Appose™ ULC 35W (Covidien, США) (рис. 1). Рис. 1. Этап реализации эксцизионной модели травмы кожи: операционное животное с фиксированными шинами (описание в разделе «Материал и методы») На поверхность одной раны накладывали мембрану криогеля, на поверхность другой - коммерческий гидрогель Hydrosorb® comfort (Paul Hartmann AG, Германия). Для поддержания влажной среды в ране шины покрывали адгезивной пленкой Hydrofilm® (Paul Hartmann AG, Германия). Отбор тканевого материала для проведения гистологических исследований осуществляли по окончании срока наблюдения в каждой группе животных на 3 и 7 сут после проведения прижизненной перфузии раствором 4% формалина в ФСБ Забор материала проводили путем иссечения скальпелем участка раны с зоны травмы с захватом прилегающей к ране ткани, локализованной под шиной (3 мм от края раны), не затрагивая гиподермы Тканевые образцы фиксировали в растворе 4% формалина в ФСБ Качественный и количественный анализ клеточного состава регенерирующей дермы осуществляли методом светлопольной микроскопии на микроскопе AxioObserver Z1 (Carl Zeiss, Германия) с использованием воздушного объектива с увеличением x40 При идентификации фибробластов учитывали размеры клеток и цитологические особенности строения Подсчет клеток производили при увеличении x40 не менее чем в десяти полях зрения на трех случайным образом отобранных срезах, полученных из одного и того же Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 оригинальные исследования 31 участка раны у всех животных в группе. Интенсивность синтетических процессов фибробластов выявляли стандартным методом окрашивания коллагеновых волокон по Ван Гизону [21]. Для статистической обработки результатов применяли t-критерий Стьюдента. Результаты и обсуждение Влияние криогеля желатина на активность фибробластов in vitro. Полученный на основе желатина экспериментальный криогель представляет собой гидрогель, характеризующийся наличием крупных (размером 50-150 мкм) взаимопроникающих пор (рис 2) Подобная макропористая структура способствует диффузии воды и питательных компонентов в составе криогеля Для изучения процессов миграции ФКЧ, мембрану криогеля культивировали на поверхности монослоя клеток в течение 9 сут Методом ЛСКМ установлено, что ФКЧ мигрируют из монослоя в матрикс в течение первых 3 сут. культивирования и обнаруживаются как в объеме криогеля, так и на его противоположной поверхности Согласно результатам ЛДГ-теста, количество ФКЧ в матриксе увеличивается линейно пропорционально времени культивирования (рис. 3), что коррелирует с данными микроскопии. Это показывает, что ФКЧ проникают и равномерно заселяют криогель желатина Подобная инфильтрация матрикса фибробластами не наблюдается при использовании плотных гидрогелей на основе желатина (данные не представлены), по-видимому, вследствие ограниченной диффузии в них питательных и газообразных веществ и затрудненной миграции клеток Таким образом, макропористый криогель является биосовместимым матриксом, поддерживающим рост фибробластов кожи человека in vitro и, следовательно, представляющим интерес в качестве биоматериала для заживления раневых дефектов кожи Рис. 2. ЛКСМ-изображение криогеля желатина, полученного в условиях криополимеризации глутаровым альдегидом Время (сутки) Рис. 3. Пролиферация ФКЧ в криогеле желатина по данным ЛДГ-теста. Активность ЛДГ оценивали по изменению оптического поглощения НАДН при 340 нм за 1 мин в пересчете на массу криогеля. Представлены средние значения ± стандартные отклонения Влияние криогеля желатина на активность фи-бробластов в модели эксцизионной раны кожи крыс. Криогель желатина и материал сравнения - допущенный к применению гидрогель Hydrosorb® comfort - в форме круглой мембраны (0 = 12 мм) наносили на поверхность двух симметричных эксци-зионных ран кожи крысы (рис. 1) так, как описано в разделе «Материал и методы». Анализ срезов, окрашенных гематоксилин-эозином, выявил качественные и достоверные (р<0,05) количественные различия в раневом процессе при использовании исследуемых биоматериалов Так, при использовании материала сравнения (Hydrosorb® comfort) наблюдалась интенсивная воспалительная реакция вплоть до 7 сут после травмы, что выражалось в инфильтрации регенерирующей дермы полиморфноядерными лейкоцитами как в области демаркационной линии, так и в центре эксцизион-ной раны с незначительным числом фибробластов, не превышающим 19,2±0,9% (р<0,05) от общего числа клеток (табл ) В отличие от материала сравнения, в случае применения криогеля желатина фи-бробласты в значительном числе детектировались на 3 сут после травмы с последующим переходом в преобладающий клеточный тип, достигая к 7 сут эксперимента в центре раны величины 73,7±3,1% (р<0,05) от общего числа клеток (табл. ). Для оценки синтетической активности фибробла-стов в регенерирующей дерме и выявления новообразованных волокон соединительной ткани был использован метод окрашивания коллагеновых волокон по Ван Гизону [21]. Как следует из рис. 4, криогель желатина способствует интенсивному образованию грануляционной ткани, характеризующейся существенным количеством более упорядоченных и зрелых коллагеновых волокон, чем при использовании гидрогеля Hydrosorb® comfort Гены & клетки Том X, № 4, 2015 32 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Таблица. Количество дермальных фибробластов в области демаркационной линии и в центре эксцизионной раны на 3-и и 7-е сут. после травмы Группа животных Число фибробластов, % от общего числа клеток 3 сут. 7 сут. Демаркационная линия Hydrosorb® comfort 3,2±0,2* 4,0±0,3* Криогель желатина 29,2±0,9** 54,2±2,4** Зона регенерирующей дермы эксцизионной раны Hydrosorb® comfort 11,7±0,6* 19,2±0,9* Криогель желатина 64,8±2,9** 73,7±3,1** Контроль 44,0±2,9 * - различия достоверны между экспериментальными группами животных и контрольной группой при р<0,05; ** - различия между группой животных с применением криогеля желатина достоверны как по сравнению с контрольной группой, так и с Hydrosorb® comfort при р<0,05. Согласно предшествующим исследованиям, наиболее значительные морфологические изменения в кожных ранах происходят в течение первых 7 сут. заживления [8, 12, 18, 22]. Результаты показывают, что криогель желатина способствует формированию в регенерирующей дерме кожи сети коллагеновых волокон разной степени зрелости, сопоставимой со структурой интактной кожи, за меньший период времени (рис. 4). Это коррелирует с преобладанием фи-бробластического дифферона клеток, выявленного при количественной оценке клеточных типов (табл. ). Известно, что в сосочковом слое (рыхлая волокнистая соединительная ткань) интактной дермы преобладают макрофаги, а в сетчатом слое (плотная волокнистая соединительная ткань) - фибробласты и фиброциты [17]. В совокупности, характеристика клеточного состава в зоне травмы и визуальный анализ срезов, окрашенных по Ван Гизону, свидетельствуют о формировании новообразованной дермы, близкой по структуре к сетчатому слою Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о том, что криогель на основе желати Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 33 на, обладающий макропористой структурой, способствует ускорению восстановления соединительной ткани в дерме, по-видимому, посредством усиления процессов миграции, пролиферации и синтетической активности фибробластов Выяснение механизма влияния криогеля на дермальные фибробласты и фазы раневого процесса требует проведения дальнейших исследований Полученный криогель является перспективной основой создания макропористых матриксов для культивирования клеток человека и регенерации тканей

About the authors

A. A Yergeshov

Kazan (Volga Region) Federal University

Z. Y Siraeva

Kazan (Volga Region) Federal University; Kazan State Medical University

R. R Kazakova

Kazan (Volga Region) Federal University

R. I Mullin

Republic Clinical Hospital

D. M Davliev

Republic Clinical Hospital

A. A Zakirova

Kazan (Volga Region) Federal University; Republic Clinical Hospital

T. I Salikhova

Kazan (Volga Region) Federal University

E. V Kuznetsova

Kazan (Volga Region) Federal University

D. T Luong

Kazan (Volga Region) Federal University

I. N Savina

University of Brighton

T. I Abdullin

Kazan (Volga Region) Federal University; Biomedtech KFU Ltd

Email: tabdulli@gmail.com

References

Supplementary files