Comparative analysis of serums and mediums for fibroblasts cultivation

Abstract

Full Text

Известно, что процесс клеточной экспансии значительно зависит от состава культуральной среды, способствующей не только получению необходимого количества клеток, но и их размножению без потери морфо-функциональных свойств. Культуральная среда, в зависимости от задач исследования, стандартно дополняется определенным количеством сыворотки животного происхождения. Являясь источником ростовых факторов, цитокинов, гормонов и липопротеидов, сыворотка служит фактором, определяющим пролиферативный и функциональный потенциал клеток. В настоящее время наряду с классической прописью, включающей использование сывороток животного происхождения, все чаще рассматривается использование промышленных культуральных сред - бессывороточных и низкосывороточных. В этой связи нами проведена оценка большинства имеющихся на российском биотехнологическом рынке бессывороточных и низкосывороточных сред и сред с добавлением сывороток различного происхождения (плодов коров (FBS), крупного рогатого скота (BS), телячьей сыворотки (FCS), сыворотки человека (аутогенной). В качестве критерия оценки тестируемых сред использовали эффективность колониеобразования фибробластов (ЭКО-ф), полученных из двух источников - кожи и десны человека. Материал и методы. Сыворотки и среды. В табл. 1 представлены сыворотки, источник их происхождения, процентное содержание в культуральной среде. В табл. 2 - промышленные бессывороточные среды и среды, с низким содержанием сыворотки. Биоптаты дермы и десны (диаметром 2-4 мм) получали от здоровых доноров (n = 10, возраст 25-48 лет) под местным обезболиванием 2% раствором лидокаина. Выделенные путем ферментативной обработки биоптатов ММСКные клетки десны и кожи культивировали в условиях 37°C, 5% CO2 в стандартной среде (DMEM/HG, 10-20% FBSd, 40 мкг/мл гентамицина). Замену среды осуществляли 2-3 раза в неделю. Клетки пассировали при достижении 8090% монослоя. Клональный анализ проводили после 2-го пассажа. Посев фибробластов производили с плотностью 90 клеток на 25 см2 чашки Петри. Клетки культивировали в течение 14 дней (среда DMEM/HG с добавлением тестируемой сыворотки или тестируемая промышленная среда), после чего образовавшиеся колонии окрашивали по стандартной методике красителем KaryoMAX® Giemsa Stain Stock Solution (Gibco, США), затем изучали количество колоний и морфологию составляющих их клеток. Таблица 1. Сыворотки, используемые для культивирования № п/п Сыворотка Сокращение Производитель Содержание сыворотки для КО,% 1 Аутологичная сыворотка крови донора HuS - 20% 2 FBS defined FBSd HyClone, США 20% 3 FBS Characterized FBSch HyClone, США 20% 4 FBS Research Grade FBSrg HyClone, США 20% 5 Fetal clone III Fcl3 HyClone, США 20% 5 FBS MSC FBS MSC Gibco, США 20% 6 FCS FCS Eurobio, Европа 20% 7 FBS EU FBS EU PAA, Австрия 20% 8 FBSgold FBS gold PAA, Австрия 20% 9 FBS ESC tested FBS ESC PAA, Австрия 20% 10 FBS USA FBS USA PAA, Австрия 20% 11 FBS South America FBS SA Biowest, США 20% Таблица 2. Промышленные культуральные среды № п/п Среды Производитель Описание среды Бессывороточные среды 1 Stem Pro MSC SFM/StPro Gibco, США DMEM, нуклеиновые кислоты 2 Panserin 401/Pan401 PAN-Biotech, США IMDM, следовые элементы, альбумин, холестерол, витамины, липиды сои 3 Panserin 411/Pan411 PAN-Biotech, США IMDM, следовые элементы, альбумин, холестерол, липиды сои, витамины, инсулин Низкосывороточные среды 4 Mesen Pro RS/MesPro Gibco, США DMEM, нуклеиновые кислоты, 2% FBS 5 Advenced MEM/AdvMEM Gibco, США MEM, ITS, следовые элементы, 2% FBS 6 Advenced DMEM/AdvDM Gibco, США DMEM, ITS, следовые элементы, 2% FBS 7 Advenced DMEM-F12/AdvDM-F12 Gibco, США DMEM/F12, ITS, следовые элементы, 2% FBS Полная среда для фибробластов 8 Quantum 333/Q333 PAA, Австрия MEM, инсулин, следовые элементы, глюкоза, сыворотка Результаты. В зависимости от используемой сыворотки и промышленных сред ЭКОф кожи варьировала от 13±2% до 51±8%, десны - от 34±20% до 75±6% (рис.). Полученные данные позволили разделить исследуемые сыворотки на две группы. Сыворотки первой группы - FBS MSC, FBS SA, FBSrg, FBSch и FBSdef способствовали высокой ЭКОф кожи (51±8%) и ЭКОф десны (75±6%); сыворотки второй группы - FCS, Fetcl3, FBS ESC, FBS USA, FBS EU и FBSgold - низкой ЭКОф кожи (10±1%) и средней ЭКОф десны (42±13%). Применение аутосыворотки крови человека (HuS), низкосывороточных сред - AdvMem, MesPro и полной среды для фибробластов - Q333 способствовало среднему уровню ЭКОф: кожи - 31 ±3%, десны - 54±4% (HuS); кожи - 26±4%, десны - 54±2% (AdvMem, MesPro и Q333) (см. рис.). В бессывороточных средах - StPro, Pan411, Pan401 и низкосывороточной AdvDM образование колоний фибробластами кожи, практически, отсутствовало (4±2%), а ЭКОф десны было достаточно низким (25±5%). Следует отметить, что использование культуральной среды с FBS, обеспечивающей высокую ЭКОф, способствовало получению первичной культуры фибробластов (и кожи, и десны) во всех случаях без исключения, в отличие от бессывороточных сред, где данный процесс всегда был безуспешным. Выводы 1. Самая высокая ЭКОф наблюдается в средах с использованием сывороток группы FBS. Однако следует учитывать, что в зависимости от производителя разные лоты одной партии сыворотки могут значительно варьировать, поэтому перед использованием лоты сыворотки следует тестировать и выбирать наиболее эффективные. 2. Использование аутосыворотки и промышленных сред AdMEM, MesProRS, Quantum 333 может служить перспективной альтернативой FBS. 3. Интересно отметить, что фибробласты, полученные из десны человека, по ЭКОф превосходят фибробласты кожи в 1,5-2,0 раза. ЭКОф кожи и десны: * - отличие ЭКОф для сывороток первой группы от сывороток второй группы с p<0,05; ** - достоверное отличие между фибробластами кожи и десны с p<