Determination of the hierarchy among multipotent human hematopoietic cells

Full Text

Мультипотентность и способность к долговременному самообновлению являются главными качествами гемопоэтических стволовых клеток [ГСК]. Следующей ступенью в иерархии гемопоэтических клеток являются мультипотентные клетки-предшественницы [МПП], которые сохраняют множественный дифференцировочный потенциал, но утрачивают способность к долговременному самообновлению. Иммунофенотипические характеристики, определяющие иерархию среди этих популяций клеток человека, пока еще не были четко определены.

Ранее было показано, что фракции клеток костного мозга и пуповинной крови человека, содержащие ГСК, обогащены Lin^-CD34⁺CD38^-CD90⁺ клетками [1, 2]. R. Majeti и соавт. предложили использовать в качестве дополнительного маркера антиген CD45RA, с помощью которого удалось продемонстрировать, что Lin^-CD34⁺CD38^- фракция клеток костного мозга и пуповинной крови человека могут быть разделены на три субпопуляции: CD90⁺CD45RA^-, CD90^-CD45RA^- и CD90^-CD45RA⁺ клетки.

Lin^-CD34⁺CD38^- клеточные субпопуляции были выделены из образцов пуповинной крови человека с помощью FACS, с чистотой >95%. Методом колониеобразующего теста в среде Methocult, авторы оценили дифференцировочный потенциал всех трех субпопуляций. CD90⁺CD45RA^- и CD90^-CD45RA^- клетки формировали все типы миелоидных колоний. Из 180 CD90^-CD45RA⁺ клеток всего 6 образовали колонии, что свидетельствует об ограниченном дифференцировочном потенциале этой популяции. Для оценки способности к пролиферации, одиночные клетки [n=20] из каждой популяции помещались в среду без сыворотки, с добавлением Flt-3, SCF, ТРО, IL-3, IL-6 и культивировались в течении 2-х недель, после чего подсчитывалось количество жизнеспособных клеток. CD90⁺CD45RA^- клетки интенсивно пролиферировали [среднее количество образовавшихся клеток - 345000], CD90^-CD45RA^- клетки пролиферировали с меньшей скоростью [среднее количество образовавшихся клеток - 67500], и CD90^-CD45RA⁺ клетки пролиферировали очень слабо с образованием всего нескольких живых клеток. Эти результаты позволяют предполагать, что CD90 субпопуляции клеток являются менее примитивными, по сравнению с CD90⁺ субпопуляциями.

Клетки каждой из популяций помещались в среду без сыворотки, с добавлением цитокинов и после 4-х дней культивирования анализировались на экспрессию CD90 и CD45RA. CD90⁺CD45RA^- клеточная популяция давала начало всем трем субпопуляциям, CD90^-CD45RA^- клеточная популяция дифференцировалась в CD90^-CD45RA⁺, а CD90^-CD45RA⁺ клетки давали начало только себе подобным. В совокупности эти данные устанавливают иерархию клеток in vitro, в которой CD90⁺CD45RA^- клетки дают начало CD90^-CD45RA^-клеткам, а те в свою очередь дают начало CD90^-CD45RA⁺ клеткам.

Для экспериментов по трансплантации клеток in vivo авторы статьи использовали новорожденных мышей линии NOD/SCID/IL-2Rg null [NOG], предварительно подвергнув их облучению в сублетальных дозах. Трансплантация как CD90⁺CD45RA^-, так и CD90^-CD45RA^- клеток приводила к тому, что через 12 недель в периферической крови, костном мозге и селезенке мышей отмечались CD45⁺ человеческие миелоидные и В-лимфоидные клетки. В пересчете на 100 трансплантированных клеток, у животных, которым были пересажены CD90⁺CD45RA^- клетки наблюдался в несколько раз более высокий уровень химеризма (в 7-9 раз) и обнаруживалось больше человеческих миелоидных клеток (также в 7-9 раз), чем у мышей, которым были пересажены CD90^-CD45RA^-клетки.

При трансплантации CD90⁺CD45RA⁺ клеток в периферической крови, костном мозге и селезенке животных не отмечалось человеческих клеток даже на сроке 4-х недель после трансплантации.

Для установления иерархических взаимоотношений между исследуемыми популяциями in vivo, анализировали иммунофенотип человеческих Lin^-СD34⁺СD38^- клеток в костном мозге привитых мышей. Все три субпопуляции были обнаружены у мышей привитых CD90⁺CD45RA^- клетками, только две CD90^- субпопуляции обнаруживались у мышей привитых CD90^-CD45RA^- клетками. Таким образом, среди Lin^-СD34⁺СD38^- клеток можно установить дифференцировочную иерархию in vivo, на верхней ступени которой находятся CD90⁺CD45RA^- клетки, далее следуют CD90^-CD45RA^- клетки, и наконец, CD90^-CD45RA⁺ клетки (рис.).

Способность к долговременному самообновлению является ключевой характеристикой отличающей ГСК от МПП и определяется как способность к вторичной трансплантации. Исследователи протестировали способность CD90⁺CD45RA^- и CD90^-CD45RA^- клеток к трансплантации вторичным реципиентам. Человеческие CD45⁺ клетки были отмечены у 100% (12 из 12) мышей, которым были пересажены клетки от CD90⁺ первичных реципиентов и только у 37,5% (3 из 8) мышей, которым были пересажены клетки от CD90^- первичных реципиентов.

R. Majeti и соавт. продемонстрировали, что популяция CD90^-CD45RA^- клеток пуповинной крови является мультипотентной, обладает ограниченной способностью к самообновлению и в гематопоэтической иерархии находится на ступень ниже CD90⁺CD45RA^- клеточной популяции. По мнению авторов, CD90^-CD45RA^- клетки представляют фракцию мультипотентных клеток-предшественниц в гемопоэзе человека.

В данном исследовании впервые был применен подход с использованием набора маркеров Lin^-СD34⁺СD38^- CD90⁺CD45RA^- и новорожденных NOG мышей, что позволило выделить фракцию клеток с ГСК активностью в гораздо меньшем числе клеток, чем в предыдущих работах.

Выделение новой фракции мультипотентных клеток предшественников может иметь большое значение для изучения и терапии острого миелобластного лейкоза. В серии экспериментов по ксенотрансплантации было показано, что стволовые клетки лейкоза [СКЛ] локализованы в Lin^-СD34⁺СD38^- CD90 фракции лейкозных клеток [3, 4]. Исследователи предполагают, что выделенная в данной работе фракция мультипотентных клеток-предшественников является теми самыми клетками, которые могут давать начало СКЛ. R. Majeti и соавт. надеются выявить генетические или эпигенетические изменения, которые ведут к трансформации МПП в способные к долговременному самообновлению СКЛ.

По материалам: Majeti R., Park C., Weissman I. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors. Cell Stem Cell 2007; 1: 635-45

About the authors

A. D. Krasnodembskaya

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Figure

Download (455KB)

Indexing metadata