Эффективная трансдукция стромальных клеток жировой ткани человека с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса
- Авторы: Шевченко ЕК1, Макаревич ПИ1, Цоколаева ЗИ1, Ратнер ЕИ1, Парфенова ЕВ1
-
Учреждения:
- Выпуск: Том 5, № 1 (2010)
- Страницы: 60-64
- Раздел: Статьи
- Статья получена: 11.01.2023
- Статья опубликована: 15.03.2010
- URL: https://genescells.ru/2313-1829/article/view/121496
- DOI: https://doi.org/10.23868/gc121496
- ID: 121496
Цитировать
Полный текст
Открытый доступ
Доступ предоставлен
Доступ платный или только для подписчиков
Аннотация
Наиболее перспективное направление в клеточной трансплантологии - использование генетически модифицированных клеток - своеобразный альянс клеточной и генной терапии. Стро-мальные клетки жировой ткани ССКЖП благодаря возможности выделения их в большом количестве у пациентов при минимальном хирургическом вмешательстве, а также высокому уровню экспрессии ими различных митогенных, антиапоптотических и ангиогенных факторов могут стать важнейшим инструментом клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. В данной работе изучена возможность генетического модифицирования СКЖТ человека с помощью плазмидных конструкций и рекомбинантного аденоассоциированного вируса CpAABJ.
СКЖТ человека выделяли из жировой ткани доноров, взятой при хирургической операции. Клетки на ранних пассажах трансфицировали плазмидой pcDNA3GFP, используя различные протоколы, а также трансдуцировали рААВ, несущим ген зеленого флуоресцентного белка [GFPJ, либо VEGF. Эффективность трансдукции клеток определяли микроскопическим анализом и методом проточной цитофлуориметрии. Уровень экспрессии трансгена анализировали с помощью иммунофер-ментного анализа и иммуноблоттинга.
С помощью проточной цитофлуориметрии определили наличие в популяции СКЖТ клеток, которые несут на своей поверхности гепарансульфат протеогликан, рецептор, через который происходит связывание вируса с клеткой. Было показано, что 55-85% популяции СКЖТ экспрессируют данный белок. Эффективность трансдукции СКЖТ рекомбинантным вирусом, выраженная в процентном содержании флуоресцирующих, GFP-позитивных, клеток, составила 60+7%. Флуоресценцию GFP наблюдали, в течение месяца. Клетки, трансдуцированные вирусом с VEGF, секретировали в 20-30 раз больше белка по сравнению с немодифицированными клетками.
Впервые показана возможность использования рекомбинантного адено-ассоциированного вируса человека для эффективной доставки терапевтического гена в стромальные клетки жировой ткани человека.
СКЖТ человека выделяли из жировой ткани доноров, взятой при хирургической операции. Клетки на ранних пассажах трансфицировали плазмидой pcDNA3GFP, используя различные протоколы, а также трансдуцировали рААВ, несущим ген зеленого флуоресцентного белка [GFPJ, либо VEGF. Эффективность трансдукции клеток определяли микроскопическим анализом и методом проточной цитофлуориметрии. Уровень экспрессии трансгена анализировали с помощью иммунофер-ментного анализа и иммуноблоттинга.
С помощью проточной цитофлуориметрии определили наличие в популяции СКЖТ клеток, которые несут на своей поверхности гепарансульфат протеогликан, рецептор, через который происходит связывание вируса с клеткой. Было показано, что 55-85% популяции СКЖТ экспрессируют данный белок. Эффективность трансдукции СКЖТ рекомбинантным вирусом, выраженная в процентном содержании флуоресцирующих, GFP-позитивных, клеток, составила 60+7%. Флуоресценцию GFP наблюдали, в течение месяца. Клетки, трансдуцированные вирусом с VEGF, секретировали в 20-30 раз больше белка по сравнению с немодифицированными клетками.
Впервые показана возможность использования рекомбинантного адено-ассоциированного вируса человека для эффективной доставки терапевтического гена в стромальные клетки жировой ткани человека.
Ключевые слова
Список литературы
- Zuk Р.А., Zhu М., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002; 13(12): p. 4279-95.
- Planat-Benard V., Silvestre J.S., Cousin B. et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation 2004; 109(5): 65B-B3.
- Seo M.J., Suh S.Y., Bae Y.C. et al. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 328(1): 258-64.
- Strem B.M., Zhu M., Alfonso Z. et al. Expression of cardiomyocytic markers on adipose tissue-derived cells in a murine model of acute myocardial injury. Cytotherapy 2005; 7(3): 282-91.
- Rehman J., Traktuev D., Li J. et al., Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation 2004; 109(10): 1292-8.
- В. Трактуев Д.О., T.B.A., Марч К.П., Парфенова Е.В., Стромальные клетки жировой ткани - мультипотентные клетки с терапевтическим потенциалом для стимуляции ангиогенеза при ишемии тканей. Кардиология 2006. 46: 53-63.
- Nakagami Н., Maeda К., Morishita R. et al. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005; 25(12): 2542-7.
- Traktuev D.O., Prater D.N., Merfeld-Clauss S. et al. Robust functional vascular network formation in vivo by cooperation of adipose progenitor and endothelial cells. Circ Res. 2009; 104(12): 1410-20.
- Kwon I., Schaffer D.V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm Res. 2008; 25(3): 489-99.
- Buning H., Perabo L, Coutelle 0. et al. Recent developments in adeno-associated virus vector technology. J Gene Med. 2008; 10(7): 717-33.
- Smith R.H. Adeno-associated virus integration: virus versus vector. Gene Ther. 2008; 15(11): 817-22.
- McCarty D.M., Young S.M., Samulski R.J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 2004; 38: 819-45.
- Peden C.S., Burger C, Muzyczka N. et al. Circulating anti-wild-type adeno-associated virus type 2 (AAV2) antibodies inhibit recombinant AAV2 (rAAV2)-mediated, but not rAAV5-mediated, gene transfer in the brain. J Virol. 2004; 78(12): 6344-59.
- Moskalenko M., Chen L, van Roey M. et al. Epitope mapping of human anti-adeno-associated virus type 2 neutralizing antibodies: implications for gene therapy and virus structure. J Virol. 2000; 74(4): 1761-6.
- Summerford C, Samulski R.J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 1998; 72(2): 1438-45.
Дополнительные файлы
