Vol 5, No 1 (2010)

На сегодняшний день в мире проведено большое количество доклинических и клинических исследований по применению ауто- и аллофибробластов для коррекции патологии кожи, продемонстрировавших безопасность и эффективность таких трансплантаций. Вместе с тем, в нашей стране этот процесс еще существенно отстает от мирового уровня. На Ваш взгляд, насколько предлагаемые методики безопасны, эффективны, реализуемы в наших условиях? Могут ли они быть объектом коммерческой медицины?

Ученые из Великобритании - Остин Смит (Austin Smith) и Ян Чемберс (Ian Chambers) несколько лет плодотворно сотрудничают, исследуя плюрипотентные клетки и, в частности, роль гомеобоксного белка Nanog. Шесть лет назад они вместе с коллегами из Эдинбургского университета впервые охарактеризовали этот транскрипционный фактор [1]. Независимо и одновременно с ними показали особую роль Nanog в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) японские исследователи во главе с Синъя Яманака (Shinya Yamanaka) [2]. Хотя приоритета в открытии Nanog у британцев нет, своим необычным названием этот фактор обязан шотландцу по происхождению Яну Чемберсу. Ян Чемберс назвал его Nanog в честь кельтской мифической земли вечной юности - Tír na nÓg.

Процесс перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные in vitro является достаточно сложным для изучения. Наиболее проблематично оценить количественные характеристики и временные рамки происходящих критических событий. Причиной этого является клеточная и генетическая гетерогенность полученных de novo трансформированных соматических клеток. Для тога, чтобы обойти необходимость вирусной трансдукции и уменьшить гетерогенность экспрессии перепрограмирующих факторов, была изобретена «вторичная» перепрограммирующая трансгенная система, в которой все соматические клетки обладают одинаковым паттерном интеграции препарат-индуцируемых вирусных трансгенов 0ct4, Sox2, Klf4 и с-Мус [1-3]. Используя эту систему на клетках линии В-лимфо-цитов Nanog-GFP репортерных мышей, коллектив исследователей из Whitehead Institute for Biomedical Research и Massachusetts Institute of Technology взялся решить ряд актуальных вопросов эпигенетики: - как происходит развитие процесса перепрограми-рования генетической системы клеток в течение времени и что происходит с преобладающим количеством клеток, которые не становятся перепрограммированными в течение продолжительных клеточных делений на фоне экспрессии перепрограммирующих факторов? - за счет чего некоторые соматические клетки, обошедшие механизмы клеточного старения и апоптоза в результате экспрессии 0ct4, Sox2, Klf4 и с-Мус, превращаются в индуцированные плюрипотентные стволовые CiPSD клетки раньше других? - все ли взрослые донорские клетки, экспрессирую-щие факторы 0ct4, Sox2, Klf4 и с-Мус, в конечном счете станут iPS-клетками, или это может быть достигнуто за счет дополнительных генетических или молекулярных манипуляций? - ограничена ли высокая перепрограммирующая способность только для клеток, не принадлежащих к каким-либо линиям дифференцировки, и взрослым стволовым клеткам?

Транскрипционный фактор р53 играет важную роль в процессах регуляции клеточного цикла, супрессии опухолей и предупреждении возникновения рака. р53 способен останавливать клеточный цикл на стадии G1-S посредством активации транскрипции гена белка р21 [WAF1 ], который является ингибитором CDK2. Остановка клеточного цикла между G1-S фазами вызывается повреждениями ДНК, что дает возможность системам репарации восстановить нормальную структуру ДНК [1 ]. Если же повреждения не поддаются полной репарации, то р53 способен индуцировать апоптоз таких клеток через активацию проапоптического белка АраМ [2]. Неудивительно, что р53 представляет собой, пожалуй, наиболее распространенную мишень для генной терапии злокачественных новообразований [3]. Этот факт имеет под собой научную основу, поскольку мутации гена р53 встречаются приблизительно в половине случаев злокачественных новообразований [4]. В настоящий момент разработано большое количество препаратов для лечения злокачественных новообразований, которые должны заменять мутантную форму р53 на нормальную. Одним из самых важных этапов разработки данного типа лекарственных средств являются клинические испытания, которым и посвящены описанные ниже две работы американских и китайских ученых.

Достижения клеточных технологий на сегодняшний день нашли свое клиническое применение главным образом в лечении пациентов со злокачественными гематологическими заболеваниями, где трансплантация красного костного мозга или гемопоэтических стволовых клеток [ГСК] после протоколов химиотерапии и облучения является неотъемлемой частью терапии [1, 2]. Трансплантация HLA-совместимого клеточного материала зачастую неосуществима из-за отсутствия подходящих доноров, в связи, с чем возникает проблема пожизненной иммуносупрессии для нивелирования реакции «трансплантат против хозяина», что ведет, в свою очередь, к возможности развития двух основных причин смерти пациентов: инфекционным осложнениям и рецидиву лейкоза [2]. Если профилактические мероприятия, направленные на снижение риска активации оппортунистических инфекций, многочисленны и разнообразны [ограничительные меры: диета, минимизация контактов с источниками инфекции; использование противомикроб-ных препаратов, введение лимфоцитов в различных вариантах], то предупреждение рецидивов лейкозов является наиболее проблемным вопросом. Подтверждением этого является высокая частота рецидивов - от 20 до 60% в зависимости от вида лейкоза и стадии процесса [3].

Regenerative medicine is one of quickly developing and promising areas of medicine in which there is essentially new approach to restoration of damaged organs by stimulation and Cor) use of stem (progenitor) cells for acceleration of regeneration. To realize this approach, it is necessary to know: what are stem cells? What are regional stem cells? What are their phenotype and potencies? Stem cells are already identified for a number of organs and tissues (epidermis, skeletal muscle) and their niche is determined. However liver, the organ whose regenerative abilities are known since antique times, has not opened its main secret yet - the secret of a regional stem cell. In this review on the basis of our own and literature data we discuss our hypothesis that perisinusoidal stellate liver cells can be liver stem cells.

Efficacy of critical limb ischemia gene therapy can be improved by application of novel plasmid vectors with higher transgene expression. The goal of this study is to evaluate in vitro and in vivo expression of angiogenic growth factors after gene transfer using a novel plasmid vector PC4W. Plasmid constructs with genes of human VEGF185 CpC4W-hHGFopt), HGF CpC4W-hHGFopt) and angiopoietin-1 (pC4W-hAng-1optJ were tested in vitro in a HEK293T cell culture. Cells were subjected to calcium-phosphate transfection and conditioning medium samples were assayed for transgene levels using Western blot and ELISA. Results were compared with commercially available pcDNA3 based vectors encoding the same growth factors. Reverse transcription PCR was used to assay transgene expression in BALB-c mice ischemic muscle. ELISA and Western blotting data suggest that PC4W based constructs give a higher protein output of about 2-2,5 fold compared with pcDNA3 based plasmids. Optimization of nucleotide sequence in growth factors cDNA results in additional increase in transgene expression. RT-PCR data shows that expression of human HGF persists in murine ischemic skeletal muscle up to 14 days after gene transfer. Our results indicate that novel plasmid constructs for angiogenic growth factors expression have a good efficacy in vitro and in vivo and can be used for VEGF1B5, HGF and angiopoietin-1 expression in human cell culture and in experimental animals' tissue. At the moment all developed constructs pass through a series of experiments in animal ischemia models and will be used for combined gene therapy development.

Despite the initial indications of positive therapeutic effects in cell therapy there are still limitations in numbers of autologous cell populations available without significant ex vivo expansion. Autologous adipose stromal cells CASCJ transplantation due to sufficient cell numbers, their multipotency and the ability to secret angiogenic growth factors may become an alternative tool to treat cardiovascular diseases. In this study we Investigated the ability to efficiently transfer gene into such cells using plasmid and recombinant adeno-associated virus (rAAVJ. Human ASC were isolated from adipose tissue obtained from different donors during surgical operations. Low passaged cells were transduced using gene delivery system CStratagene] based on recombinant adeno-associated virus (rAAVJ serotype 2 encoding human vascular endothelial growth factor (VEGF) or green fluorescent protein (GFP). Transduction efficiencies and transgene expression level in ASCs were analyzed by quantitative flow cytometry and ELISA. ASC population was analysed for heparan sulfate proteoglycan expression, the main cellular AAV binding receptor. It was found that 55-65% of human ASC population express this receptor. The efficiency of ASC transduction using AAV delivery system was found to be 60+7%. GFP expression was visible during a month. Relative to control, cells transduced by VEGF rAAV vector increased VEGF secretion level by at least 20-30 fold as compared to unmanipulated ASC. Recombinant adeno-associated virus provides efficient tools for ex vivo modification of human ASCs.

Treatment of complications of portal hypertention at liver cirrhosis also includes as preventive maintenance of varieces bleedings of a gullet various ways, and as treatment of hepatocellular insufficiency. The result of complex treatment with application of surgical methods and to stimulation of liver regeneration transplantation fetal tissue for correction of hepatocellular insufficiency are submitted.

5 мая 2010 г. исполняется 80 лет со дня рождения и 55 лет научно-практической и общественной деятельности профессора, доктора медицинских наук, академика Международной академии наук экологии, безопасности человека и природы (МАНЭБ), главному специалисту Российского НИИ травматологии и ортопедии им. P.P. Вредена Владимиру Ильичу Савельеву. Его юность пришлась на годы Великой Отечественной войны. Для него, одного из жителей блокадного Ленинграда, познавших все ужасы военного времени, горечь многочисленных потерь, выбор профессии не стал проблемой. Он мечтал стать врачом, и поступление в медицинский институт стало воплощением его жизненных устремлений. Благодаря блестящим знаниям, приобретенным в период обучения в Ярославском медицинском институте, в 1955 г. он был зачислен в аспирантуру, работая одновременно на кафедре топографической анатомии и исполняя обязанности ассистента кафедры нормальной анатомии. Защитив в 1959 г. кандидатскую диссертацию, В.И. Савельев по конкурсу был избран ассистентом кафедры общей хирургии Кемеровского медицинского института, а в 1961 г. был назначен научным руководителем лаборатории консервации и трансплантации органов и тканей Новосибирского НИИ травматологии и ортопедии. Умение концентрировать внимание на важных практических проблемах, сочетать научную и практическую деятельность позволило В.И. Савельеву за короткий период выполнить ряд актуальных научных разработок, результаты которых легли в основу успешно защищенной им в 19Б7 г. докторской диссертации. В 1973 г. В. И. Савельев по конкурсу был избран руководителем аналогичной лаборатории Ленинградского [ныне Российского] НИИ травматологии и ортопедии им. P.P. Вредена.