Successful obtaining of human blastocysts by SCNT

Full Text

Вопрос клонирования животных и человека, несмотря на морально-этические противоречия, находит все больше заинтересованных исследователей. Как правило, официальная цель подобных исследований озвучивается как получение пациент-специфичных линий стволовых клеток, а идея создания истинного клона человека не афишируется. В настоящее время получены клоны целого ряда млекопитающих [1-3], однако исследования в области клонирования человека пока еще малочисленны. Это связано не только с этическими ограничениями, но и с проблемами в оформлении соответствующей документации и разрешений на работу с яйцеклетками человека.

Уже были предприняты первые шаги по созданию эмбрионов человека «альтернативным путем». В частности, воспроизведены ранние стадии эмбриогенеза [до бластоцисты] с использованием в качестве клеток-доноров т. н. «кариопласта», линии эмбриональных стволовых клеток [ЭСК] человека [4], фетальных фибробластов [5]. Однако успешность результатов не была подтверждена методами генного анализа.

Основным методологическим направлением, применяющимся для реализации идеи клонирования, является перенос ядра [nuclear transfer, NT], суть которого состоит в объединении ядра донорской клетки [кариопласта] с цитоплазмой овоцита II деления мейоза [цитопластом]. В соответствии с этим протокол NT включает ряд обязательных этапов: энуклеирование овоцита, подготовку донорского ядра, перенос его в цитопласт, а также активацию, инициирующую эмбриональное развитие [6]. Каждый шаг последовательности может быть выполнен с помощью различных методик. Например, введение генетического материала клетки-донора ядра в цитоплазму овоцита II порядка потенциально осуществимо как клеточным слиянием, так и микроинъекцией ядра [7].

В январе 2008 года в онлайн версии журнала Stem Cells опубликованы материалы исследования A.J. French с соавт. о клонировании человека. В этой работе в качестве источника ядра использовали соматические клетки взрослого человека - фибробласты кожи. Иными словами, эксперимент выполнен посредством метода переноса ядра соматической клетки [somatic cell nuclear transfer, SCNT], который ранее был успешно проведен в работе по клонированию приматов [3].

В исследовании использовались 29 зрелых овоцитов II деления мейоза, энуклеация которых производилась двумя разными способами: экструзией и аспирацией. Первый способ заключается в том, что заостренной стеклянной микропипеткой осуществлялось «выдавливание» ядра через цитоплазматическую мембрану и прозрачную оболочку. Второй способ предполагал экстрагирование тем же инструментом ядросодержащей области цитоплазмы [в 12 случаях - с первым полярным тельцем]. Преимуществ одного метода перед другим выявлено не было.

Отбор фибробластов 3-5-го пассажа производился посредством проточной цитометрии, а также по морфологическому критерию, основанному на данных А.С. Boquest [1999], в соответствии с которыми 95% клеток диаметром 10-15 мкм находятся в оптимальной для использования стадии клеточного цикла - в G₁ [или G₀] периоде [9]. Нужно отметить, что экспериментальное обоснование зависимости диаметра и фазы клеточного цикла, которое учитывали авторы работы, было показано для фетальных фибробластов. Нормальный диплоидный набор хромосом фибробластов подтверждался цитогенетическим анализом. Интеграция системы «кариопласт-цитопласт» производилась посредством клеточного слияния.

Полученные путем SCNT клетки через 2-3 часа после слияния, а также овоциты II деления мейоза были подвергнуты партеногенетической активации. В первые 24 часа у 7 зигот, полученных посредством SCNT, наблюдались деградация и лизис, однако у 66% клеток через 6-7 часов после химической активации выявлялись процессы ремоделирования ДНК. На третий день из группы SCNT-овоцитов было получено 10 морул, состоящих из 5 и более клеток, а на пятый-шестой день определялось 5 бластоцист, количество бластомеров которых находилось в пределах 41-72. Столько же бластоцист исследователи получили партеногенетической активацией овоцитов II деления мейоза, но в их составе насчитывалось порядка 35-54 клеток.

Исходный клеточный материал и бластоцисты были подвергнуты генной дактилоскопии [анализ митохондриальной и ядерной ДНК] с целью установления соответствия последовательностей ДНК бластоцист и донорских клеток, а также выявления возможного «загрязнения» в процессе осуществления технических мероприятий. В двух случаях в каждой группе не удалось показать достоверных данных, касающихся происхождения бластоцист. В остальном, генотип зародышей, полученных посредством SCNT, соответствовал генотипу донорских фибробластов и не включал фрагменты генетического материала овоцитов. Характерно, что вследствие клеточного слияния, наряду с внесением в цитопласт ядра от фибробласта, происходит передача и митохондриальной ДНК соматической клетки. В дальнейшем, по всей видимости, митохондрии, принадлежавшие овоциту замещаются новыми, а митохондриальная ДНК цитопласта подвергается вырождению.

Таким образом, A.J. French с соавт. впервые воспроизвели начальные этапы клонирования человека с использованием метода SCNT. Показав идентичность генома полученных бластоцист и донорских клеток, исследователи не осуществляли детальный хромосомный анализ, нацеленный на выявление возможных хромосомных аббераций, не выявляли уровни экспрессии критических эмбриональных генов, таких как Oct 4, Cdx2 и др., то есть не доказали, что клетки были полностью репрограммированы.

По материалам: French A.J., Adams C.A., Anderson L.S. Fibroblasts Development of Human cloned Blastocysts Following Somatic Cell Nuclear Transfer [SCNT] with Adult Fibroblasts. Stem Cells 2008; 26:485-93

About the authors

I. Ya. Bozo

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation

References

Supplementary files