Features of generation and differentiation of iPSCs into retinal cells for modeling human hereditary diseases

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В 2007 году Такахаши и Яманака [1] произвели революцию в области моделирования заболеваний благодаря преобразованию терминально-дифференцированных клеток в ИПСК мыши, подобные эмбриональным стволовым клеткам, за счет принудительной экспрессии 4 генов:  OCT4, SOX2, KLF4 и C-MYC. Многочисленные работы в настоящее время продемонстрировали возможность создания ИПСК человека из соматических клеток [1-4], что обеспечило бурное развитие направления исследований заболеваний человека, для которых отсутствуют релевантные животные модели или ограничен доступ к первичным тканям и клеткам человека.

На протяжении многих десятилетий понимание патогенеза и лечение заболеваний сетчатки полагались на иммортализованные клеточные линии сетчатки, гистологию человеческих глаз, животные модели, клинические наблюдения и генетические исследования. Получение специфичных для пациента ИПСК добавило мощный альтернативный инструмент для обнаружения новых мутаций, вызывающих заболевания, изучения взаимосвязей между генотипом и фенотипом, проведения скрининга терапевтической токсичности и разработки персонализированной клеточной терапии оптических нейропатий и ретинопатий – наиболее распространенных типов патологий зрительной системы, при которых происходит дегенерация ганглиозных клеток сетчатки (и как следствие – атрофия зрительного нерва) или поражаются клетки пигментного эпителия и фоторецепторы, соответственно. Для достижения этих целей было разработано и успешно применено множество различных протоколов по получению из соматических клеток ИПСК с их последующей дифференцировкой. Данный обзор рассматривает разнообразные протоколы дифференцировки ИПСК, полученных из клеток здоровых и больных доноров, в ганглиозные клетки сетчатки и ретинальные клетки с акцентом на состав среды, длительность дифференцировки, наблюдаемые биологические эффекты получаемых клеточных культур, в том числе органоидов, и перспективы использования таких моделей. Статья может быть полезна исследователям, изучающим патогенез различных наследственных форм слепоты и разработчикам подходов к терапии этих заболеваний, нуждающихся в получении релевантной клеточной модели.   

 

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ИПСК В ГАНГЛИОЗНЫЕ КЛЕТКИ СЕТЧАТКИ

Важное требование перед использованием ИПСК для моделирования заболеваний – это сохранение способности ИПСК к дифференцировке в определенные типы клеток. Ганглиозные клетки сетчатки (ГСК), полученные из ИПСК путем направленной дифференцировки, могут быть полезным инструментом для изучения механизмов работы зрительного нерва и изучения патогенеза заболеваний, скрининга лекарств и клеточной терапии.

В последние несколько лет в многочисленных работах сообщается об успешной дифференцировке ИПСК в ГКС [5-11]. В табл. 1 суммированы данные о том, как протекает процесс дифференцировки ИПСК в ганглиозные клетки и какие факторы при этом используют. Следует отметить, что огромное внимание уделяется всесторонней характеризации клеток для подтверждения подлинности и качества полученных из ИПСК ганглиозных клеток. Ряд ассоциированных с ганглиозными клетками маркеров может быть использован для их анализа, например, BRN3A, BRN3B, ATOH7, TUBB3, NFM, ISLET1 и THY1 [8, 12, 13]. Однако важно отметить, что некоторые из этих маркеров не обязательно специфичны для сетчатки. Например, TUBB3 - паннейронный маркер [14], а три члена семейства BRN3 (BRN3a, BRN3b и BRN3c) также экспрессируются во множестве слуховых и соматосенсорных нейронов [15]. Это подчеркивает важность использования панели связанных с ганглиозными клетками маркеров в сочетании с морфологическим анализом и функциональными тестами для всесторонней характеристики клеток, получаемых из ИПСК. Так, было показано, что ИПСК могут дифференцироваться в ганглиозные клетки с длинными выступающими аксонами, способными к аксональному транспорту митохондрий и успешному выполнению своей физиологической функции [8, 10, 11, 16]. По мере увеличения количества исследований вполне вероятно, что возможность генерировать функциональные ганглиозные клетки из ИПСК станет более стандартизированной процедурой.

 

 

Таблица 1. Среды и длительность дифференцировки ИПСК в ганглиозные клетки сетчатки

Table 1. Types of media and the duration of differentiation of iPSCs into retinal ganglion cells

Ссылка	Источник клеток для дифференцировки	Среды и особенности процесса дифференцировки	Длительность дифференцировки (дней)
[6]	ИПСК, эмбриоидные тела	Среда [DMEM/F12, 15% FBS, 10 нг/мл bFGF, 0.1 мМмМ β-mercaptoethanol, 1 × 10−4 M nonessential amino acids, cell growth medium GlutaMAX, 50 Е/мл penicillin, 50 г/мл streptomycin; Dkk1 (100 нг/мл), Lefty A (100 нг/мл), Noggin (100 нг/мл)]	8
[7]	ИПСК	Среда [DMEM/F12 (1:1), N2 supplement, MEM nonessential amino acids, heparin (2 г/мл)]	50
[8]	ИПСК, эмбриоидные тела	Среда [DMEM/F12 (1:1), N2 supplement, MEM nonessential amino acids, heparin (2 мкг/мл)] C 50 до 70 дня добавка [BDNF (100 нг/мл) / PEDF (100 нг/мл)]	70
[9]	ИПСК, эмбриоидные тела	Среда [Neural induction medium: DMEM-F12, N2 supplement, glutamine, B27 supplement, insulin, transferrin, sodium selenite, fibronectin (ITSFn), Noggin [100 нг/мл]), FGF2] С 25 дня среда [DMEM/F12, N2 supplement, glutamine] + кондиционированная среда постнатальных 1-но дневных ретинальных клеток	50
[10]	ЭСК	Среда [1:1 mix of DMEM/F12 and Neurobasal 1 × GlutaMAX Supplement, 1 × antibiotic-antimycotic, 1% N2 Supplement, 2% B27 Supplement] С 10 дня иногда добавка [25 нг/мл FGF-8, 50 нг/мл FGF-A, 1 мМ Taurine, или 10% fetal bovine serum]	25+
[11]		Среда [G-MEM, 20% KSR, 0.1 мМ nonessential amino acids, 1 мМ pyruvate, 0.1 мМ 2-mercaptoethanol, 100 Е/мл penicillin, 100 мг/мл streptomycin) containing Y-27636 and IWR-1e (20 и 3 мМ)] На 15й день добавка [CHIR99021 (3 мМ; Wako) и SAG (100 нМ)] На 18й день среда  [DMEM/F12-Glutamax medium,N2 supplement, 100 Е/мл penicillin,  100 мг/мл streptomycin] 26-29й день добавка [retinoic acid 0.5 мМ]	34
[12]	ИПСК, эмбриоидные тела	Среда [Нейрональная индукционная среда с 100 нг/мл Noggin (или Dorsomorphin), DKK1 (or XAV939)]. С 20-40 дня добавка [Activin A (100 нг/мл), 20 нг/мл FGF2/EGF] мкг/мл В течение финальной недели добавка [5 мкг/мл heparin]	120
[13]	ИПСК, эмбриоидные тела	Среда [DMEM:F12 в соотношении 1∶1 with 10% FBS, N2 supplement, B27 supplement, 0.01 мМ NEAA, 1 мМ sodium pyruvate, 1× antibiotic-antimycotic, 5 мкМ CKI-7, 5 мкМ SB431542.] На 7й день добавка [DAPT, N-[N-(3, 5- Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester, 10 мкМ]	12
[14]	ИПСК, ЭСК, эмбриоидные тела	Среда [hES medium,10% FBS, 10 мкМ DAPT]	40

 

 

Следует также отметить, что ИПСК и производные от них ганглиозные клетки могут быть получены и от пациентов с различными нейропатиями, при этом протокол получения не отличается от такового для здоровых клеток. Клетки могут быть далее использованы в качестве модели заболевания для апробации терапевтичеких подходов, а также для изучения фенотипических и функциональных особенностей клеток, связанных с проявлением болезни. Исследования, в которых на модели клеток, полученных от пациентов с LHON, изучали дифференцировку и фенотип клеток, суммированы в табл. 2.

 

 

Таблица 2. Дифференцировка ИПСК пациентов с нейропатиями в ганглиозные клетки сетчатки и их характеризация*

Table 2. Differentiation of neuropathy patient iPSCs into retinal ganglion cells and their characterisation

Ссылка, Заболевание	Среды и особенности процесса дифференцировки, длительность	Наблюдаемые биологические эффекты на клеточной модели заболевания
[18] LHON (MT-ND4)	Среда [DMEM/F12 medium, N-2 supplement Neurobasal medium/B27, DAPT]. 40+ дней	Увеличение апоптоза и уровня активных форм кислорода (+) Уменьшение уровня экспрессии моторного протеина KIF5A (-) Возрастание числа ретроградных митохондрий и уменьшение числа стационарных митохондрий (+)
[19] LHON (MT-ND4, PRICKLE3)	Среда [DMEM/F12 1% N2, 1X Glutamax, 1X NEAA, 50 мкг/мл uridine, 1 мМ/мл sodium pyruvate, 1 нг/мл noggin10 мкМ/мл (Y27632)] С 14 дня среда [DMEM/F12, 2% B27, 1X NEAA, 50 мкг/мл uridine, 1 мМ/мл sodium pyruvate, 5 нг/мл, noggin, 10 мкМ/мл DAPT] 28 дней	Аномальная морфология ганглиозных клеток, в том числе после окрашивания на β III TUBULIN Нарушение электрофизиологических свойств клеток (-) Пониженное содержание АТФ и возрастание уровня апоптоза (-)
[20] LHON (MT-ND4)	Среда [DMEM/F12 (1:1), 1% N2 supplement, non-essential amino acids (NEAAs), 2 мг/мл heparin] С 16 дня среда [DMEM/F12 (3:1) 2% B27 (без vitamin A), NEAA, antibiotic] 56 дней	Дефектный рост нейритов (-) Снижение в 2 раза уровня экспрессии маркеров ганглиозных клеток BRN3A и MAP2 (-) Возрастание биогенеза митохондрий, увеличение содержания митохондриальной ДНК (+) Возрастание активности митохондриального комплекса 1 (+) Значительное снижение темпа поглощения кислорода (-) Пониженная экспрессия каталазы (-) Экспрессия 348 генов была увеличена, и 532 уменьшена
[21] LHON (MT-ND4)	Cреда [Advanced DMEM/F12, non-essential amino acid, 1% N2 supplement, 2 мг/мл heparin] С 17 дня среда [Advanced DMEM/F12 (3:1), 2% B27 (с Vitamin A)] 45 дней	Возрастание количества митохондриальной ДНК, достоверное возрастание внутриклеточных активных форм кислорода, увеличение уровня апоптоза, аномальная электрофизиология клеток (+) Изменение уровня экспрессии циркулирующих РНК, связываемое с увеличением уровня апоптоза (+)
[22] LHON (MT-ND4)	Среда [hES-среда, 10% fetal bovine serum (FBS), 10 мМ basic fibroblast growth factor (bFGF)] С 8 дня среда [hES medium, 10% FBS, 2.5 мкМ retinoic acid (RA), 10 мкМ DAPT, затем Neurobasal medium/B-27, 10 мкМ DAPT, 50 нг/мл BDNF] 25+ дней	Аномальная морфология клеток Снижение уровня экспрессии нейронального маркера TuJ1, дисфункция электрофизиологических (-) параметров, аномальные митохондрии Снижение уровня  AMPA-рецепторов, нарушение глутаматэргической передачи (-)
[23] LHON (MT-ND1, MT-ND6)	Среда [DMEM F12, GlutaMAX, 10% KSR, 1X B27, 1 нг/мл noggin, 1 нг/мл DKK1, 5 нг//мл IGF1]. С 4 дня  среда [DMEM F12, GlutaMAX, 10% KSR, 1X B27, 1X N2, 10 нг/мл noggin, 10 нг/мл DKK1, 10 нг/мл IGF1, 5 нг/мл bFGF] 25-32 дня	Возрастание клеточной гибели связанной с митохондриями, которое предотвращалось за счет технологии цибридного слияния с нормальными кератиноцитами (+)
[24] Воздействие CCCP	Среда [mTeSR среда, 5 мкМ blebbistatin, гипоксия 5% О2] С 2 дня среда [N2B27: 1:1 DMEM/F12, Neurobasal, 1X GlutaMAX supplement, 1X antibiotic-antimycotic, 1% N2 supplement и 2% B27 supplement Forskolin (FSK; 25 мкМ), Dorsomorphin (DSM; 1 мкМ), IDE2 (2.5 мкМ), Nicotinamide (NIC; 10 мМ)]	Нарушения в пути деградации митохондрий

 

Так в работе [17] изучалась возможность получения линии ИПСК из клеток пациента с нейропатией Лебера. Была успешно сгенерирована линия клеток, несущая мутацию m.3635G>A в гене MT-ND1, что было подтверждено ПЦР анализом, а также in vivo исследованиями по формированию тератом. В работе [18] полученные из ИПСК пациента ганглиозные клетки изучали с точки зрения аксонального транспорта митохондрий. Было обнаружено изменение ретроградного, но не стационарного транспорта и увеличение количества апоптотических клеток. Аномальная морфология ганглиозных клеток и нарушение функций было отмечено у ганглиозных клеток, полученных из ИПСК пациентов [19]. У ганглиозных клеток также нарушалась биологическая активность и изменялся профиль экспрессии генов по сравнению с нормальными клетками [20]. Кроме того, в одной работе было показано, что у ганглиозных клеток наблюдается повышенный уровень апоптоза, связанный с гиперэкспрессией циркулирующей РНК [21]. В еще одном исследовании, посвященном получению ганглиозных клеток из ИПСК пациентов с LHON было показано снижение уровня экспрессии генов, связанных с глутаматэргической синаптической передачей сигналов [22]. Повышение уровня апоптоза в ганглиозных клетках сетчатки клеток пациентов с LHON было успешно нивелировано с помощью гибридной технологии «лечения» клеток, которая заключается в замене мутированных митохондрий клеток здоровыми митохондриями от донорских кератиноцитов [23]. Нарушения в пути деградации митохондрий было также обнаружено в ганглиозных клетках, полученных из ИПСК пациента с LHON [24].

 

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ИПСК В РЕТИНАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

Простейший способ получения соматической клетки из плюрипотентной стволовой клетки обычно называется спонтанной дифференцировкой. Плюрипотентные стволовые клетки выходят из плюрипотентности по пути развития одного из трех зародышевых листков: эктодермы, энтодермы или мезодермы [25]. Спонтанная дифференцировка подразумевает адгезивное или суспензионное культивирование и опирается на врожденную спецификацию клеточной судьбы [26]. Этот путь неэффективен, длителен и сильно варьируется между линиями для получения одного конкретного типа клеток для исследовательских целей и заключается в иссечении пигментированных участков из гетерогенных культур. Знания, полученные в результате эмбриологических исследований сигнальных путей развития, позволили исследователям разработать более сфокусированные, направленные протоколы дифференцировки ИПСК в клетки ретины.

Направленная или управляемая дифференциация использует кондиционированные среды, содержащие факторы роста или небольшие молекулы, такие как основной фактор роста фибробластов (bFGF), антагонист костного морфогенетического белка (BMP) Noggin (NOG), Wnt, антагонист Dickkopf-1 (DKK1), никотинамид, казеинкиназу (CK), Ингибитор I 7, ингибитор ALK4 SB-431542 и ингибитор Rho-ассоциированной киназы Y-27632 для модуляции специфических сигнальных путей, имитации эндогенной коммуникации и управлении решением о клеточной судьбе ИПСК [27-31]. Эмбриональные стволовые клетки [27, 29, 32] или ИПСК [33-35] успешно дифференцируются в клетки ретины. Производные ИПСК, включая клетки ретинального эпителия, могут быть относительно незрелыми [12], однако они демонстрируют характеристики, подтверждающие их ценность в качестве модели патофизиологии взрослого человека. В частности, показано, что клетки ретинального эпителия, полученные из ИПСК, экспрессируют специфичные для них маркеры, такие как VSX2, CRX, RCVRN, MATH5, MITF [36, 37] и функционально активны, как нативные зрелые клетки ретины [38–40]. Важно отметить, что ретинальный эпителий, полученный из ИПСК, сохраняет сложные генетические сигнатуры и варианты, связанные с патогенезом, что делает их ценным инструментом в моделировании заболеваний. Результаты работ суммированы в табл. 3.

 

 

Таблица 3. Среды и длительность дифференцировки ИПСК в ретинальные клетки сетчатки

Table 3. Types of media and the duration of differentiation of iPSCs into retinal cells

 

Ссылка	Источник клеток для дифференцировки	Среды и особенности процесса дифференцировки		Длительность дифференцировки (дней)
[27]	ИПСК	Среда [DMEM/F12, 1× B27, 1× N2, и 1× NEAA] Со 2 дня добавка [50 нг/мл Noggin, 10 нг/мл Dkk1,  10 нг/мл IGF1 10 мМ nicotinamide или 5 мМ 3-aminobenzamide] С 2 по 4 день добавка [10 нг/мл Noggin, 10 нг/мл Dkk1, 10 нг/мл IGF1, 5 нг/мл bFGF] С 4 по 6 день добавка [10 нг/мл Dkk1, 10 нг/мл IGF1, иногда 100 нг/мл Activin A] С 6 по 14 день добавка [100 нг/мл Activin A, 10 мкМ SU5402, 1 мМ VIP]	14
[28]	ЭСК	Среда [KO-DMEM, 14% KO serum replacement, 1% nonessential amino acids, 2 мМ glutamine, 50 Е/мл penicillin, 50 мкг/мл streptomycin, 10 мМ NIC] C 3 и 4 недели добавка [Activin A 20–180 нг/мл, TGF-β1 (2.5 нг/мл), SB431542 (5 мкМ или 50 мкМ), bFGF (20 нг/мл)]	8 недель
[29]	ЭСК или ИПСК	Среда [Y-27632 (10 мкМ)  в течение 1 часа, DMEM/F-12 supplemented, 0.1 мМ 2-mercaptoethanol, 0.1 мМ non-essential amino acids, 2 мМ L-glutamine,] До 3 дня добавка [20% KSR] До 6 дня добавка [10% KSR medium] До 9 дня добавка [15% KSR] До 15 дня суспензионной культуры добавка [Y-27632 (10 мкМ)] До 21 дня добавка  [CKI-7 (5 мкМ) и SB-431542 (5 мкМ)]	90+
[30]	ИПСК	Среда [DMEM:Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamine), 1% MEM nonessential amino acids, and 1% N2 supplement] На 14 день добавка [10 нг/мл FGF2] На дни между 21 и 28 или 28 и 35 днем добавка [10 мкМ DAPT]	35
[31]	ЭСК Эмбриоидные тела	Среда [20 мкМ Y-27632 10% KSR, gfCDM 45% Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM), 45% Hams F12 (F12), Glutamax, 1% chemically defined lipid concentrate, monothioglycerol (450 мкМ), На 6 день добавка и её концентрация разбавлялась вдвое каждый третий день [100 U ml−1 pe BMP4 1.5 nM (55 нг/мл)] Среда для долгого культивирования [NR-differentiation medium’ DMEM/F12-Glutamax medium, 1% N2 supplement, 10% foetal bovine serum (FBS), 0.5 мкМ retinoic acid, 0.1 мМ taurine, 0.25 мкг ml−1 Fungizone, 100 Е/мл−1 penicillin, 100 мкг/мл−1 streptomycin.]	50+
[12]	ЭСК или ИПСК	На 2–4 день добавка [100 нг/мл Noggin (или Dorsomorphin), DKK1 (или XAV939) Activin A (100 нг/мл) На 20–40 день [20 нг/мл FGF2/EGFмкгмкг] C 20 по 27 день добавка [5 мкг/мл heparin]	120

 

Многие дистрофии сетчатки поражают несколько типов клеток, следовательно, необходимо глубокое понимание механизмов межклеточных взаимодействий при патогенезе, которые не могут быть воспроизведены в гомогенной двумерной культуре, полученной из ИПСК.  Поэтому в настоящее время разрабатываются и оптимизируются новейшие методологии для того, чтобы создавать трехмерные модели сетчатки in vitro, которые называются органоидами сетчатки. Органоиды сетчатки, ламинарной (послойной) структуры, позволяют повысить уровень сложности клеточных культуральных моделей [41, 42]. Эти самоорганизующиеся сетчатки можно использовать для исследования взаимодействий между различными слоями клеток, причем для некоторых из них даже была показана реакция на свет [12, 36]. Преимуществом такого подхода является способность развивать нейронную сетчатку пациента in vitro для изучения взаимодействия между различными типами клеток сетчатки.

В частности, при заболеваниях сетчатки, при которых дегенерация ретинального эпителия приводит к гибели фоторецепторов, нарушению пространственной организации и временной передачи сигналов между двумя типами клеток, органоиды могут помочь в понимании механизмов болезни. Существующие протоколы получения органоидов сетчатки воспроизводят ткань, содержащую ретинальные клетки сетчатки и фоторецепторы с рудиментарными внешними сегментами, которые рассматриваются как потенциальный источник для трансплантации клеток. Органоиды являются мощным инструментом для моделирования заболеваний сетчатки и имитации патологической физиологии, наблюдаемой у пациентов, страдающих этими заболеваниями.

Несмотря на значительный прогресс, остается еще много проблем, связанных с использованием органоидов сетчатки [43]: прежде всего различия между партиями; методы для получения клеток, пригодных для трансплантации, из органоидов сетчатки [43, 44]; безопасность и длительное выживание трансплантированных клеток или тканей in vivo [44]; и, наконец, эффективность формирования нейронной цепи у хозяина. К примеру, методы индукции органоидов сетчатки могут быть разделены на три категории. Первая категория адаптирует процесс 2D к 3D, но без прохождения стадии эмбриоидных тел [45, 46]. Согласно этому протоколу, ИПСК культивируют до 70% конфлюентности в специфической среде в чашках для культивирования до образования самообразующихся нейроэпителиоподобных структур, которые появляются примерно через 4 недели. Два других характерных протокола задействуют эмбриональные стволовые клетки, диссоциацию и дорастание до эмбриоидных тел с последующим формированием нейроэпителиоидных структур [30, 47]. Хотя технология получения органоидов сетчатки сделала большой скачок вперед за последние годы, остается еще много проблем, связанных с использованием органоидов, такие как высокая гетерогенность между клеточными линиями и результатами экспериментов, длительное время культивирования, прогрессирующая дегенерация внутренних слоев клеток и чистота клеток-мишеней.

Отдельного внимания заслуживает дифференцировка ИПСК клеток пациентов с ретинопатиями в ретинальные органоиды для изучения и моделирования заболеваний (табл. 4). Такие органоиды с пониженным уровнем экспрессии гена AIPL1 и PDE6 были получены из клеток ИПСК пациентов с амаврозом Лебера несмотря на то, что органоиды демонстрировали нормальную цитоархитектуру [48]. Рекапитулирование заболевания было показано при анализе ретинальных органоидов, полученных из ИПСК с нокаутом по гену AIPL1 [49]. В еще одном исследовании было показано, что ретинальные органоиды пациентов с амаврозом Лебера имеют неопределяемые количества гена AIPL1, а также PDE6 по сравнению с контрольными культурами [50]. Ретинальные клетки, полученные из ИПСК пациента с макулярной телангиктазией демонстрировали нарушение в митохондриальной функции [51]. Аномальные ретинальные клетки образовывались из ИПСК пациента с пигментным ретинитом [52]. А в другом исследовании моделирование пигментного ретинита с помощью полученных из ИПСК ретиноидных органоидов показало массированную гибель клеток после их формирования [53].

 

 

Таблица 4. Дифференцировка ИПСК пациентов с ретинопатиями в ретинальные клетки сетчатки и их характеризация*

Table 4. Differentiation of retinopathy patient iPSCs into retinal cells and their characterisation

Ссылка, заболевание	Среды и особенности процесса дифференцировки, длительность	Наблюдаемые биологические эффекты на клеточной модели заболевания
[48] LCA4	Среда [DMEM/F12 (1:1), 1x N2 supplement, 1X MEM non-essential amino acids (NEAA), 2 мкг/мл heparin] С 14 дня среда [NRM, DMEM:DMEM/F12 (2:1), 1x B27 (Invitrogen), 1X NEAA, и 1% antibiotic–antimycotic] C 42 дня добавка [NRM 10% FBS (Gibco), Taurine (100 мкМ), all-trans retinoic acid (1 мкМ)] С 93 дня добавка [рутениевая кислота до 0,5 мкМ] 93 дня	Сохранение ретинальной цитоархетиктуры Уменьшенный уровень экспрессии AIPL1 и PDE6 в пациентских органоидах (-) Изменение уровня экспрессии большого числа генов в пациентских органоидах
[49] ИПСК нокаутные по гену AIPL1 LCA4	Среда [Advanced DMEM/F12 (1:1), 1% non-essential amino acids (NEAA), 1% N2 supplement, 1% GlutaMAX, 1% antibiotic–antimycotic] C 42 дня среда [DMEM/F12 nutrient mix (3:1 ratio), 10% foetal bovine serum (FBS), 2% B27 supplement (без vitamin A), 100 мкМ taurine, 2 мМ GlutaMAX, 100 Е/мл penicillin/streptomycin] 70 день  добавка [1 мкМ retinoic acid] 84 день добавка [1% N2 и RA понижался до 0.5 мкМ] 84+ дней	Морфология органоидов была нормальной AIPL1 не детектировался (-) Нокаут выразился в снижении уровня экспрессии PDE6α и β, и увеличенном уровне cGMP , что свидетельствует о дисрегуляции каскада фототрансдукции
[50] LCA 4	Среда [Без фидера на среде E8 затем после индукции на FGF-free среде B27, N2 индукционная среда] После индукции среда [FGF-free среде B27, N2 индукционная среда] Затем B27,  FBS, taurine, Среда для созревания [B27, N2, taurine] 230 дней	Нормальные ретинальные органоиды AIPL1 и PDE6 не детектировался (-) Повышенный уровень cGMP (+)
[51] MacTel	3 недели в среде [Knockout DMEM, 20% Knockout Serum Replacement, 2 мМ l-glutamine, 1% penicillin/streptomycin, 10 мМ nicotinamide, 0.1 мМ β-mercaptoethanol,  1% nonessential amino acid (NEAA) solution] C 4 по 5 неделю среда [differentiation media , 31 нг/мл activin A ] C 6 недели первый вариант среды 16-18 недель	Нормальный фагоцитоз Пониженный уровень серина и глицина (-) Нарушения в пути окислительного фосфорилирования (OXPHOS) Активация путей стрессового метаболизма (+) Дисрегуляция центрального метаболизма углерода Снижение функции митохондрий (-)
[52] RP	Среда [DMEM, 20% knockout serum replacement, 1× non-essential amino acids, 50 мкМ β-mercaptoethanol, 1% penicillin–streptomycin and 10 мМ nicotinamide.] С 7 до 14 дня добавка [100 нг/мл Activin A в течение недели] C 14 дня добавка[3 мкМ CHIR99021] С 42 дня поддерживающая среда без индукторов 12+недель	Аномальная морфология клеток Нарушение в структуре апикальных микроворсинок Пониженная экспрессия специфичных генов (LAMA1, VTN, CACNA1I, CAMK4, ADY2, DRD2) (-) Снижение фагоцитоза (-)
[53] XLRP	Среда [Neural induction medium, blebbistatin мкМ] До 140 дня добавка [0.5 мкМ retinoic acid] 180+ дней	Гибель рецепторных клеток после 150 дня (-) Утончение внешнего слоя органоида после 180 дня (-) После трансдукции аденоассоциированным вирусом наблюдалось восстановление дегенеративного фенотипа, утолщение внешнего слоя и восстановление экспрессии родопсина (+)

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Велико число людей, теряющих зрение из-за поражения клеток сетчатки глаза, при которых обычные методы лечения дегенерации сетчатки не являются эффективными (17-24, 48-53).

В настоящее время исследователям удается эффективно перепрограммировать соматические клетки с помощью различных методов, в том числе с использованием эписомальных векторов и мРНК, сохраняющих целостность клеточного генома и усиливающих эффективность репрограммирования [54, 55]. Кроме того, теперь можно создавать ИПСК с использованием клеток, полученных неинвазивными методами, например, клеток почечного эпителия из образца мочи, что особенно актуально для детей и в обстоятельствах, когда нецелесообразно получать биопсию [56, 57]. Помимо этого, получение ИПСК из взрослых соматических клеток ликвидирует многие вопросы религиозных и этических соображений, связанных с ЭСК. Важно отметить, что ИПСК, как и ЭСК, представляют собой почти неограниченный источник клеточного материала, полученного от пациентов, из-за присущей им способности к самообновлению, сохраняя при этом способность генерировать клетки из трех зародышевых листков [58].

Успешное моделирование дегенерации сетчатки зависит от понимания взаимосвязи между клиническим фенотипом заболевания и молекулярными и клеточными особенностями специфических генетических вариантов в клетках сетчатки, полученных из ИПСК.

Хотя потенциал ИПСК сделал их идеальным инструментом для моделирования заболеваний, некоторые свойства в настоящее время ограничивают их клиническое применение. Это прежде всего геномная нестабильность и вмешательство в геном в ходе репрограммирования [59, 60], а также другие изменения в экспрессии генов [61-64].

Исследования также показали, что ИПСК могут сохранять экспрессию генов и иметь профиль метилирования ДНК как у соматических клеток, в состоянии, известном как частично перепрограммирование ИПСК, что снижает их способность к дифференцировке [65–68]. Непредсказуемая изменчивость между клонами может быть связана с соматическим происхождением ИПСК, методом перепрограммирования или клональной изменчивостью внутри индивидуума. Более того, успешная характеристика клонов ИПСК на плюрипотентность не означает равную способность этих клонов к образованию линии сетчатки. Необходимы дальнейшие исследования для установления селекционного скрининга и критериев уменьшения клональной изменчивости и идентификации клонов ИПСК, которые имеют оптимальную способность к дифференцировке сетчатки. Возможно, что для диагностического и терапевтического использования ИПСК могут возникнуть разные критерии установления плюрипотентности. Несмотря на перечисленные проблемы, изучение ИПСК и их применение в биомедицинских исследованиях достойны дорогостоящих инвестиций.

About the authors

Evgeniy Lapshin

Sirius University of Science and Technology

Author for correspondence.
Email: evgeniy_lapshins@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-4404-2758

Младший научный сотрудник направления "Генная терапия"

Аспирант

Russian Federation

Julia Gershovich

Email: jg.gershovich@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6740-438X
Russian Federation

Ekaterina Minskaya

НТУ Сириус

Email: minskaya.es@talantiuspeh.ru
ORCID iD: 0000-0002-1137-373X
SPIN-code: 9750-6964

к.б.н. , Ведущий научный сотрудник направление "

Alexander Karabelsky

НТУ Сириус

Email: karabelskiy.av@siriusuniversity.ru
ORCID iD: 0000-0002-6391-5182
SPIN-code: 6898-8414

Кандидат биологических наук , Руководитель направления "Генная терапия"

Russian Federation

References

Supplementary files