Tumor cell-free DNA detection-based liquid biopsy of plasma and bile in pancreatic ductal adenocarcinoma: a pilot study

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В соответствии с результатами эпидемиологического исследования GLOBOCAN, в 2020 году во всём мире было выявлено 496 тыс. новых случаев протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (ПАПЖ). Она занимает 14-е место среди всех онкологий по заболеваемости и 7-е место по смертности: ежегодно эта разновидность рака уносит жизни 466 тыс. пациентов [1]. Диагностика на ранних стадиях заболевания затруднена ввиду отсутствия специфических симптомов, что вместе с агрессивностью опухоли служит одной из основных причин низкой 5-летней выживаемости при ПАПЖ (до 5%) [2]. По оценкам экспертов, к 2030 году ПАПЖ может выйти на 2-е место по смертности среди всех онкологических заболеваний, уступая лишь раку лёгких [3].

Одна из наиболее перспективных технологий диагностики ПАПЖ — жидкостная биопсия. Данный термин используется в качестве собирательного названия различных методов выявления опухолевых дериватов в биологических жидкостях организма, таких как кровь, моча, ликвор и др. Аналитическими мишенями жидкостной биопсии чаще всего выступает внеклеточная опухолевая ДНК (воДНК), однако активно изучаются экзосомальная ДНК, циркулирующие опухолевые клетки, различные РНК и «обученные опухолью» тромбоциты [4]. Чтобы отличить воДНК от внеклеточной ДНК (вДНК), для здоровых клеток применяют как анализ hot-spot-мутаций, характерных только для опухолевых клеток, так и анализ паттернов эпигенетической регуляции.

Известно, что при ПАПЖ в опухолевом биоматериале в 64–70% случаев встречаются мутации в гене KRAS, причём практически все нуклеотидные замены приходятся на кодоны 12, 13 и 61, что делает эти мутации удобной мишенью для анализа не только с помощью секвенирования, но и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) [5, 6]. Благодаря этому жидкостная биопсия плазмы по воДНК при ПАПЖ стала активно изучаться, однако в ряде случаев у пациентов с известным генотипом опухоли выявить воДНК в плазме не удаётся. Причина этого — в целом низкое содержание вДНК в данном биоматериале: зачастую в 1 мл плазмы встречаются всего несколько молекул воДНК, что существенно повышает вероятность ложноотрицательного результата [7].

Теоретически более концентрированной в плане содержания воДНК альтернативой плазме может служить желчь ввиду малого объёма, возможности прямого контактирования с опухолью при её инвазии в желчные протоки и непрямого — через межклеточную жидкость. В 75–80% случаев опухоль локализуется в головке поджелудочной железы, и в большей части подобных случаев у пациентов наблюдаются нарушения оттока желчи, требующие дренирования желчных путей, что позволяет провести забор этого биоматериала [8, 9].

Цель пилотного исследования — сравнение диагностического потенциала жидкостной биопсии по воДНК желчи и плазмы у пациентов с ПАПЖ.

В качестве метода количественного анализа воДНК выбрана цифровая капельная ПЦР благодаря её устойчивости к ингибиторам ПЦР, присутствие которых ожидаемо при выделении нуклеиновых кислот из желчи, а также высокой аналитической чувствительности, превосходящей таковую в случае применения ПЦР в режиме реального времени и секвенирования нового поколения [10, 11].

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Дизайн пилотного исследования

Работа одобрена Локальным этическим комитетом Медицинского-научно-образовательного центра Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (протокол № 12/21 13 декабря 2021 г.) по заявлению АО «Ильинская больница». Всеми участниками подписано добровольное информированное согласие. Включение пациентов проводилось в период с января 2022 по июнь 2022 г. на базе АО «Ильинская больница».

В пилотное исследование включено 15 пациентов с впервые выявленной первичной ПАПЖ и нарушениями оттока желчи. Морфологическую верификацию диагноза выполняли при помощи толстоигольной биопсии первичной опухоли или метастаза печени с гистологическим исследованием, при локализованных опухолях проводили эндосонографию с цитологическим анализом. Визуализацию и описание пространственных параметров злокачественного новообразования осуществляли с использованием КТ, МРТ и позитронно-эмиссионной томографии/КТ с ¹⁸ФДГ по показаниям. Во всех случаях определяли сывороточный уровень СА 19-9 (Ед/мл) методом иммуноферментного анализа.

В контрольную группу для установления порогового уровня ложноположительных капель при анализе воДНК методом цифровой капельной ПЦР вошли 15 здоровых добровольцев в возрасте 18–24 лет без жалоб на состояние здоровья и при отсутствии сведений о раке желудочно-кишечного тракта в семейном анамнезе. Клинико-демографическая характеристика участников исследования представлена в табл. 1. Все лабораторные манипуляции выполняли на базе Медицинского-научно-образовательного центра Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

 

Таблица 1. Клинико-демографическая характеристика участников исследования

Table 1. Clinical and demographic characteristics of study participants

Параметр | Parameter	Группа ПАПЖ | PDAC group, n=15	Здоровые добровольцы | Healthy volunteers, n=15
Возраст, лет | Age, years	64,6 (44,0–75,0)	21,6 (18,0–24,0)
Пол, n: | Sex, n: • мужчин | male • женщин | female	7 8	7 8
Локализация опухоли в поджелудочной железе, n: | Tumor localization in pancreas, n: • головка | head • головка + тело | head + body • головка + тело + хвост | head + body + tail	11 3 1	Н/д | N/a Н/д | N/a Н/д | N/a
Размер опухоли, n: | Tumor size, n: • >4 см | >4 cm • 2–4 см | 2–4 cm • <2 см | <2 cm	7 7 1	Н/д | N/a Н/д | N/a Н/д | N/a
Контакт опухоли с артериями, n | Contact of tumor with arteries, n	11	Н/д | N/a
Контакт опухоли с венами, n | Contact of tumor with veins, n	13	Н/д | N/a
Инвазия опухоли в желчные протоки, n | Invasion of tumor into pancreatic ducts, n	14	Н/д | N/a
Отдаленные метастазы, n | Distant metastasis, n	3	Н/д | N/a

Примечание: ПАПЖ — протоковая аденокарцинома поджелудочной железы, н/д — нет данных; возраст представлен в виде среднего (разброс).

Note: PDAC — pancreatic ductal adenocarcinoma, n/a — not available; age is presented as mean (range).

 

Сбор и пробоподготовка биоматериала

У всех пациентов были собраны образцы периферической венозной крови в объеме 12 мл в пробирки с ЭДТА, после сбора биоматериал хранили при температуре 4 °С не более 4 ч, после чего кровь центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин и плазму переносили в чистые пробирки. Затем плазму вновь центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин для осаждения оставшихся частиц и переносили в новые пробирки, которые замораживали при –80 °С.

У всех включённых в исследование пациентов с ПАПЖ отмечались нарушения оттока желчи, в связи с чем им проводили наружное дренирование желчных путей или стентирование общего желчного протока с забором желчи. Цельную желчь замораживали при –80 °С. Перед процедурой выделения ДНК, после разморозки, образцы желчи тщательно перемешивали пульс-вортексированием и подвергали двум циклам центрифугирования при тех же параметрах, что и кровь.

Выделение ДНК

Нуклеиновые кислоты выделяли из 5 мл плазмы и 5 мл супернатанта желчи с использованием набора реагентов QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (QIAGEN, Германия). Экстракцию проводили с добавлением РНК-носителя для повышения выхода нуклеиновых кислот [12]. Выделение ДНК из плазмы выполняли в строгом соответствии с инструкцией производителя, однако для супернатанта желчи протокол модифицировали: фаза лизиса биоматериала была увеличена на 30 мин. Объем элюирования ДНК составил 50 мкл.

Анализ ДНК

Количество вДНК и воДНК определяли с помощью автоматизированной системы для цифровой капельной ПЦР QX200 AutoDG (Bio-Rad, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для выявления воДНК использовали наборы олигонуклеотидных праймеров и зондов ddPCR KRAS G12/G13 Screening Kit и ddPCR KRAS Q61 Screening Kit (Bio-Rad, США), способные одновременно детектировать широкий спектр мутаций гена KRAS «в одной пробирке» без дискриминации между конкретными нуклеотидными заменами: G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D и Q61H (183A>C), Q61H (183A>T), Q61K, Q61L, Q61R соответственно. Амплификацию ДНК проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad, США) с использованием следующего протокола: инкубирование при 95 °С в течение 10 мин, 40 циклов денатурации при 94 °С в течение 30 с и отжига/элонгации при 55 °С в течение 60 с, инкубирование при 98 °С в течение 10 мин. В реакционную смесь для цифровой капельной ПЦР вносили максимально допустимый объём раствора ДНК (9,9 мкл).

Общее количество вДНК определяли как сумму количества аллелей мутантного и дикого типа. Результаты цифровой капельной ПЦР представлены как в абсолютном виде (число копий на 1 мл биоматериала), так и в виде фракции воДНК (уровень воДНК/общий уровень вДНК, %). Пороговое значение количества ложноположительных по мутантному аллелю капель эмульсии устанавливали в ходе анализа вДНК, выделенной из плазмы здоровых добровольцев.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили при помощи программного обеспечения SPSS Statistics 22.0 (IBM, США), проверку нормальности распределения — с использованием теста Шапиро–Уилка. Так как данные были распределены ненормально, использовали непараметрические статистические критерии. Для сравнения несвязанных выборок применяли критерий Манна–Уитни, для связанных — тест Вилкоксона. Для определения корреляции изучаемых данных использовали критерий Спирмена. Количественные данные представлены в виде Me (Q1–Q3) — медиана и интерквартильный размах. Результаты статистического анализа считались значимыми при p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате серии экспериментов по выявлению мутаций гена KRAS в образцах вДНК из плазмы здоровых добровольцев установлено, что максимальное значение ложноположительных капель с флуоресценцией, соответствующей опухолевым молекулам ДНК, составило всего 1 каплю эмульсии. Таким образом, все результаты анализа воДНК из биоматериала пациентов с ПАПЖ, в которых выявлялась одна или менее положительная по мутациям гена KRAS капля эмульсии, считались негативными, т.е. уровень воДНК принимали равным нулю.

В образцах желчи воДНК выявлена у 13 из 15 пациентов, в то время как среди парных образцов плазмы положительными оказались лишь 9 из 15. Причём не было ни одного случая, когда бы воДНК выявлялась в плазме, но не в соответствующем образце желчи, что подтверждает превосходство желчи над плазмой как субстрата для жидкостной биопсии. Пример результатов цифровой капельной ПЦР при выявлении мутаций KRAS в образцах вДНК из плазмы и желчи представлен на рис. 1, a и 1, b соответственно. Кластеры, соответствующие каплям эмульсии, содержащим молекулы воДНК, уверенно отделяются от кластера с вДНК из нормальных клеток (дикий тип) и кластера с каплями эмульсии, где не произошла амплификация ДНК, что делает интерпретацию результатов выявления воДНК при жидкостной биопсии методом цифровой капельной ПЦР вполне однозначной. Стоит отметить, что все случаи успешного выявления воДНК приходились на мутации в кодонах 12 и 13 гена KRAS. Был лишь один образец, содержавший мутации как в кодонах 12 и 13, так и в кодоне 61.

 

Рис. 1. Примеры результатов анализа внеклеточной ДНК в образцах биоматериала пациента с протоковой аденокарциномой поджелудочной железы: a — внеклеточная ДНК, выделенная из образца плазмы; b — внеклеточная ДНК, выделенная из образца желчи. Каждая точка на графике соответствует капле эмульсии, сгенерированной при проведении цифровой капельной ПЦР.

Fig. 1. Examples of cell-free DNA analysis output in samples from patients with pancreatic ductal adenocarcinoma: a — plasma cell-free DNA; b — bile cell-free DNA. Each dot on the graphs represents and emulsion droplet generated using digital droplet PCR.

 

Разброс уровней содержания воДНК при количественном анализе был довольно выраженным. Так, в образцах вДНК из желчи количество воДНК варьировало от 1 до 17 460 копий/мл в абсолютных значениях и от 0,05 до 26,24% в виде доли воДНК от общего уровня вДНК, в то время как в вДНК из плазмы разброс составил 2,6–137,4 копий/мл и 0,04–2,37%. Впрочем, и по абсолютным значениям, и по фракции содержание воДНК в желчи было статистически значимо выше, чем в плазме: 538,0 (4,1–1960,0) против 4,4 (0–27,6) копий/мл (p=0,005) и 1,79 (0,07–11,74) против 0,05 (0–0,57)% (p=0,009) соответственно (рис. 2, a и 2, b). Корреляция между количествами воДНК в парных образцах желчи и плазмы статистически незначима (p >0,05).

 

Рис. 2. Сравнение результатов количественного анализа внеклеточной опухолевой ДНК в парных образцах желчи и плазмы: a — представление данных в виде копий на 1 мл биоматериала; b — представление данных в виде фракции внеклеточной опухолевой ДНК от общего уровня внеклеточной ДНК, %. * — выбросы; для сохранения пропорций на рисунке 2, a скрыты выбросы со значениями 5380, 7560, 17 460 копий/мл.

Fig. 2. Comparison of cell-free tumor DNA analysis results in paired samples of plasma and bile: a — data presentation as copier per 1 ml of biomaterial; b — data presentation as fraction of cell-free tumor DNA in total cell-free DNA, %. * — to mark the outliers; outliers with exceptionally high values (5380, 7560, 17 460 copier/ml) were excluded to preserve the proportions of the diagram.

 

Связи количества воДНК как в желчи, так и в плазме с размером опухоли не выявлено (p >0,05), равно как и не выявлено различий в количествах воДНК у пациентов с наличием и отсутствием клинически подтверждённого метастазирования (p >0,05). Статистически значимой корреляции с уровнями сывороточного СА 19-9 также не обнаружено (p >0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка подходов к ранней диагностике онкологических заболеваний — ключевая задача современной медицины, которая особенно актуальна для рака со столь высокими показателями смертности и поздней выявляемостью, как ПАПЖ. Жидкостная биопсия рассматривается многими авторами как именно тот инструмент скрининга, который позволит решить вышеуказанную проблему [13, 14]. Впрочем, потенциал данной технологии к раннему выявлению опухолевых дериватов в биологических жидкостях является не только её преимуществом, но и ограничением.

Так, в исследовании M.I. Hosen с соавт. удалось выявить воДНК при анализе биобанкированных за 10 лет до манифестации заболевания образцов мочи пациентов с раком мочевого пузыря [15]. Однако в клиническом исследовании, посвящённом оценке потенциала жидкостной биопсии к скринингу того или иного злокачественного новообразования, подобный результат у пациента без клинически подтверждённого заболевания был бы расценен как ложноположительный. Подтверждением тому является факт, что в подавляющем большинстве исследований по скринингу рака с применением жидкостной биопсии специфичность не достигает 100% и колеблется в диапазоне 80–90% [7, 14]. Оценка прогностического потенциала жидкостной биопсии в отношении клинической манифестации заболевания вполне возможна, однако требует проведения крупных проспективных исследований, в рамках которых необходимо многолетнее наблюдение за субъектами скрининга, или же расширенных программ биобанкирования материала от здоровых лиц с периодическим учётом результатов диспансеризации. Несомненно, подобные значения специфичности могут объясняться не только случайным сверхранним выявлением воДНК, большой вклад оказывают и лабораторные ограничения, связанные с применением жидкостной биопсии, такие как вероятность контаминации образцов и выставление неоптимального порога отсечения ложноположительного сигнала. Авторами также используются разнообразные методики генетического анализа: от ПЦР в реальном времени до секвенирования нового поколения, каждые из которых обладают своими особенностями при работе с единичными молекулами воДНК в пробе [7, 14].

В представленном пилотном исследовании нам удалось подтвердить выдвинутую гипотезу и продемонстрировать, что жидкостная биопсия желчи при ПАПЖ повышает выявляемость воДНК по сравнению с анализом плазмы. Более того, уровень воДНК в желчи был многократно выше, что существенно снижает требования к чувствительности аналитической системы, открывая возможность применения и более доступных методов генетического анализа. Превосходящий плазму диагностический потенциал желчи продемонстрирован и для злокачественных новообразований желчных протоков и желчного пузыря [16, 17]: выявляемость воДНК в этом биоматериале была на 21–64% выше, чем в плазме, что согласуется с результатами нашего исследования.

Ключевой недостаток подобного подхода к жидкостной биопсии — высокая инвазивность сбора желчи. Злокачественные опухоли поджелудочной железы в целом характеризуются крайне поздней выявляемостью, и у 70% пациентов одним из первых симптомов при первичной постановке диагноза служит обструкция желчных путей, требующая дренирования [18]. Таким образом, в данной группе пациентов получение биоматериала сопряжено с рутинными процедурами. Может показаться, что у оставшихся 30% пациентов сбор желчи по своей инвазивности сопоставим с биопсией опухоли, однако это не так. Наиболее опасное осложнение как толстоигольной, так и тонкоигольной биопсии — распространение опухолевых клеток по ходу иглы [19, 20]. Чрескожная аспирация желчи, не затрагивающая новообразование, с куда меньшей вероятностью приведёт к подобным последствиям. Более того, при помощи дуоденального зондирования желчь и вовсе может быть собрана без нарушения целостности тканей [21]. Впрочем, необходимо признать, что из-за особенностей сбора данного биоматериала его применение для жидкостной биопсии при скрининге асимптоматических пациентов является малооправданным и, возможно, в данном случае предпочтение следует отдать плазме крови.

Обнаруженное отсутствие каких-либо значимых связей между результатами количественного анализа воДНК и клиническими параметрами в первую очередь может объясняться малым размером группы пациентов, однако существуют и другие факторы. Методы визуализации, использованные для оценки параметров опухоли, отличаются субъективностью анализа. Мутации гена KRAS считаются ранним событием туморогенеза при ПАПЖ, но это не означает, что абсолютно все переродившиеся клетки в организме содержат изучаемую мутацию — в ходе генетической эволюции, сопряжённой с ростом, опухоль способна приобретать новые hot-spot-мутации [22]. Таким образом, уровень воДНК, определённый по одной конкретной мутации, может количественно отражать лишь малую долю опухолевых клеток, тогда как размер злокачественного новообразования по данным инструментальных методов визуализации, с которым оценивается корреляция, будет соответствовать всей видимой опухоли. Так, у одного из участников нашего исследования в желчи была выявлена воДНК одновременно по мутациям как в кодонах 12 и 13, так и в кодоне 61, причём в первом случае уровень воДНК был почти в 70 раз ниже (16 против 1140 копий/мл соответственно), тогда как уровень вДНК из нормальных клеток по этим кодонам был одинаковым. Похожие случаи мы наблюдали и при жидкостной биопсии мочи, когда уровни воДНК, определённые по разным мутациям в промоторе гена TERT у одного и того же пациента, различались в 4–15 раз [23]. Подтверждением вышеназванным особенностям сравнения результатов жидкостной биопсии с данными КТ служит тот факт, что в исследованиях, посвящённых оценке корреляции уровней воДНК с размером опухоли, если и выявлялась статистически значимая связь, то её сила была лишь средне-слабой (коэффициенты корреляции — 0,32–0,54) [4].

Впрочем, это совершенно не значит, что данные количественного анализа при жидкостной биопсии по воДНК малоинтересны с клинической точки зрения. Сильная сторона данной технологии — не столько определение уровня воДНК при первичной диагностике заболевания (в данном случае оно обладает в первую очередь качественной ценностью), сколько оценка динамики изменения уровня воДНК под влиянием того или иного вида терапии. Так, в ряде исследований по жидкостной биопсии продемонстрировано, что повышение уровней воДНК/наличие детектируемой воДНК в плазме значимо ассоциированы c выживаемостью при ПАПЖ как при хирургическом, так и при химиотерапевтическом лечении [24–26].

Ограничения исследования

В связи с пилотным характером представленного исследования размер групп пациентов был довольно ограниченным; воДНК выявлялась только по ряду мутаций в кодонах 12, 13 и 61 гена KRAS, что не позволяет покрыть всю популяцию пациентов с ПАПЖ, так как у некоторых лиц с данным заболеванием опухоль имеет генотип, отрицательный по мутациям в этом гене. Не проводилось секвенирование непосредственного опухолевого материала, полученного в ходе резекции/биопсии для сопоставления генотипов, однако полное отсутствие ложноположительных результатов при использовании представленной технологии как в группе контроля, так и во время внутренних экспериментов с коммерческими контрольными образцами геномной ДНК в некоторой степени элиминировало необходимость сопоставления результатов жидкостной биопсии с данными секвенирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Жидкостная биопсия по внеклеточной опухолевой ДНК — один из наиболее многообещающих диагностических инструментов при протоковой аденокарциноме поджелудочной железы. Она обладает потенциалом как к раннему выявлению онкологического заболевания или рецидива, так и к контролю ответа на терапию. Однако на данном этапе развития технология ещё далека от внедрения в реальную клиническую практику ввиду методологической гетерогенности опубликованных исследований, высокой стоимости, отсутствия стандартизированных протоколов и завершённых крупных рандомизированных клинических исследований.

В представленной работе продемонстрировано, что у пациентов с нарушением оттока желчи жидкостная биопсия этого биоматериала имеет преимущества перед анализом плазмы, которые заключаются в существенно больших частоте выявления внеклеточной опухолевой ДНК и самих уровнях данного биомаркёра. Успех пилотного проекта позволяет приступить к основному исследованию, в рамках которого планируется расширение выборки пациентов; добавление новой группы больных с нарушениями оттока желчи, связанными с заболеваниями, требующими дифференциальной диагностики с протоковой аденокарциномой поджелудочной железы; внедрение новой технологии нормализации уровней внеклеточной опухолевой ДНК по экзогенному олигонуклеотиду, что позволит по-новому взглянуть на связь концентрации этого биомаркёра с клиническими параметрами.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках Государственного задания Медицинского научно- образовательного центра Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов: М. Джайн, Л.М. Самоходская и В.И. Егоров разработали дизайн исследования; М. Джайн, Т.И. Рахматуллин, Ю.В. Гонтарева, П.П. Ким, Т.Е. Дахтлер и Д.П. Атаян выполняли эксперименты; М. Джайн, В.И. Егоров, П.А. Попов, Т.И. Рахматуллин, Д.П. Атаян и Т.Е. Дахтлер анализировали данные; М. Джайн подготовил рукопись с участием всех соавторов; А.А. Камалов, Л.М. Самоходская, В.И. Егоров, Ю.В. Гонтарева, П.П. Ким, Т.Е. Дахтлер и Д.П. Атаян предоставили критически важные реагенты и образцы; А.А. Камалов администрировал проект. Все авторы внесли достаточный вклад в работу, получение, анализ и интерпретацию данных исследования, написание и редактирование текста, а также подтвердили соответствие своего авторства международным критериям ICMJE и одобрили финальную версию рукописи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. The study was carried out within the state assignment of Medical Research and Educational Center of Lomonosov Moscow State University.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors' contribution: M. Jain, V.I. Egorov, and L.M. Samokhodskaya designed the study; M. Jain, T.I. Rakhmatullin, J.V. Gontareva, P.P. Kim, T.E. Dakhtler, and D.P. Atayan performed experiments; M. Jain, V.I. Egorov, P.A. Popov, T.I. Rakhmatullin, D.P. Atayan, and T.E. Dakhtler analyzed data; M. Jain wrote the manuscript with input from all authors; A.A. Kamalov, L.M. Samokhodskaya, V.I. Egorov, J.V. Gontareva, P.P. Kim, T.E. Dakhtler, and D.P. Atayan provided critical reagents and samples; A.A. Kamalov administrated the project. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work in concordance with ICMJE criteria.

About the authors

Mark Jain

Medical Scientific and Educational Center, Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: jain-mark@outlook.com
ORCID iD: 0000-0002-6594-8113
SPIN-code: 3783-4441
Russian Federation, Moscow

David P. Atayan

Joint Stock Company “Ilyinsky Hospital”

Email: d.atayan@ihospital.ru
ORCID iD: 0000-0001-9816-3008
Russian Federation, Moscow Region

Tagir I. Rakhmatullin

Lomonosov Moscow State University

Email: tagir.rakhmatullin@internet.ru
ORCID iD: 0000-0002-4601-3478
Russian Federation, Moscow

Tatyana E. Dakhtler

Joint Stock Company “Ilyinsky Hospital”

Email: t.dakhtler@ihospital.ru
ORCID iD: 0000-0002-2240-6381
Russian Federation, Moscow Region

Pavel A. Popov

Joint Stock Company “Ilyinsky Hospital”

Email: p.popov@ihospital.ru
ORCID iD: 0000-0003-3300-7076
SPIN-code: 1245-1005

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow Region

Pavel P. Kim

Joint Stock Company “Ilyinsky Hospital”

Email: p.kim@ihospital.ru
ORCID iD: 0000-0003-2022-9569
Russian Federation, Moscow Region

Julia V. Gontareva

Joint Stock Company “Ilyinsky Hospital”

Email: y.gontareva@ihospital.ru
ORCID iD: 0000-0003-4900-8997
Russian Federation, Moscow Region

Larisa M. Samokhodskaya

Medical Scientific and Educational Center, Lomonosov Moscow State University

Email: slm@fbm.msu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6734-3989
SPIN-code: 5404-6202

MD, Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Vyacheslav I. Egorov

Joint Stock Company “Ilyinsky Hospital”

Email: v.egorov@ihospital.ru
ORCID iD: 0000-0002-8805-7604
SPIN-code: 4487-1663

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow Region

Armais A. Kamalov

Medical Scientific and Educational Center, Lomonosov Moscow State University

Email: priemnaya@mc.msu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4251-7545
SPIN-code: 6609-5468

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files