Cryoconservation of hemapoietic cord stem cells

Full Text

В настоящее время значительно возрос интерес к пуповинной крови (ПК) как к альтернативному источнику репопулирующих гемопоэтических клеток, пригодных для трансплантации. По принятым стандартам для адекватного восстановления гемопоэза требуется определенное количество гемопоэтических клеток на килограмм веса реципиента. Учитывая, что принципиальным недостатком пуповинной крови являются малое абсолютное количество гемопоэтических клеток и невозможность повторного получения их от того же донора, основной задачей при заготовке ПК является обеспечение наименьшей потери стволовых клеток как в количественном, так и в качественном отношении. В настоящее время в мире существует несколько методик фракционирования и криоконсервирования пуповинной крови.

С целью уменьшения общего объема крови и удаления эритроцитов и гранулоцитов для дальнейшего замораживания мы предлагаем для фракционирования пуповинной крови использовать полиглюкин, так как он имеет ряд преимуществ перед другими.

1. Полиглюкин является легко доступным стандартным препаратом
2. Использование полюглюкина не требует отмывания клеточной взвеси после его применения.
3. Полиглюкин, благодаря своим дезагрегирующим свойствам, является наиболее благоприятной средой для ядросодержащих клеток с целью их последующей криоконсервации.

Для осаждения эритроцитов смешивали полиглюкин с ПК в соотношении 1:1 (83 опыта) и в соотношении 1:2 (27 опытов). В результате проведенных экспериментов было доказано, что полиглюкин является эффективным седиментирующим веществом (процент выделенных ядросодержащих клеток 86,2 %, процент удаленных эритроцитов - 96%). Процент выделенных лейкоцитов при соотношении полиглюкина к ПК 1:1 был достоверно больше, чем при соотношении 1:2, что является наиболее важным показателем при фракционировании пуповинной крови.

Оставшийся после фракционирования пуповинной крови осадок, содержащий в основном эритроциты, гранулоциты и плазму, мы предлагаем использовать в качестве образцов для различных анализов, необходимых для тестирования ПК.

При проведении экспериментов по фракционированию ПК нами было отмечено, что фракционирование проходит более успешно при минимальном разрыве времени от момента забора до момента фракционирования.

Нами установлена обратная корреляция между процентом выделенных ядросодержащих клеток и временем хранения пуповинной крови (n = 83, r = -0,3; р<0,05 и rs = -0,22; р = 0,048 соответственно).

Наиболее ответственным этапом для сохранения жизнеспособности стволовых гемопоэтических клеток при их заготовке является этап замораживания. Мы разработали метод криоконсервирования стволовых клеток пуповинной крови с уменьшением концентрации ДМСО (диметилсульфоксид) и без использования программного замораживателя. В качестве криопротектора кроветворных клеток мы предлагаем использовать высокоочищенный диметилсульфоксид в конечной концентрации 5 % в сочетании с полиглюкином. Применение полиглюкина позволило снизить количество ДМСО вдвое: с 10% до 5-6% конечной концентрации. Мы поставили перед собой задачу разработать наиболее надежный метод замораживания пуповинной крови, который бы исключал использование электронного программного замораживателя. Основным критерием являлась скорость охлаждения биоматериала. Она должна была быть оптимальной от 1°С до 2,5°С/мин. при охлаждении пуповинной крови от 0°С до 40°С. В результате экспериментов было показано, что при замораживании биоматериала, помещенного в контейнер, выполненный из многослойной фанеры (толщина стенок 10 мм, размер соответствует размеру 2 криомешков- DF200), в парах жидкого азота скорость охлаждения ПК соответствует заданным параметрам. По разработанному методу были заморожены 167 образцов пуповинной крови. Время хранения биоматерила составило от 1 до 30 дней. Потерь ядросодержащих клеток после размораживания не было. Данный метод криоконсервирования пуповинной крови обладает большей надежностью в сравнении с замораживанием в программном электронном устройстве, так как исключаются факторы риска (человеческий фактор, отказ электроники, перебои в электроснабжении).

About the authors

V. V. Grishina

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files