IL8 matrix-metalloproteinasa concentration in blood serum in therapy with G-CSF

Full Text

Концентрация IL8 матрикс-металлопротеиназ в сыворотке крови в динамике терапии Г-КСФ.*

В последние несколько лет стало очевидным, что мобилизация ГСК - процесс до конца не изученный и достаточно противоречивый. Он обеспечивается комплексом взаимодействий между ростовыми факторами, хемокинами, протеазами и молекулами адгезии. Хотя каждый из этих участников может независимо друг от друга запускать каскад мобилизации ГСК, их пути, так или иначе, перекрещиваются и становятся взаимосвязанными. Появились факты, свидетельствующие о том, что мобилизация является результатом действия «периферических» хемокинов, таких как интерлейкин 8 (IL-8 или CXCL8), и ремоделирования матрикса и базальной мембраны энзимами матрикса, такими как желатиназа-В (ММР-9) [1-4]. Проведенные исследования убеждают, что нейтрофилы, IL-8 и ММР-9 играют ключевую роль в Г-КСФ-индуцированной мобилизации стволовых клеток. Стимуляция препаратами Г-КСФ может приводить к снижению экспрессии CD114 на нейтрофилах с последующей их активацией и повышенной продукцией IL-8, который вызывает дегрануляцию нейтрофилов и высвобождение из них различных энзимов, в том числе матрикс металлопротеиназ (ММР-9, ММР-2), эластазы, катепсина G [5-7]. Более того, нейтрофилы не продуцируют TIMP-1 и могут химически активировать латентную про-желатиназу-В. Все вместе это приводит к деградации и/или инактивации молекул адгезии, таких как VCAM-1/VLA-4, хемокинов (SDF-1/CXCR-4), растворимой фракции КIT-лиганда и др., тем самым, нарушая контакт между ГСК и костно-мозговым микроокружением. Стволовые клетки, таким образом, получают возможность беспрепятственной миграции из костного мозга через эндотелиальный барьер в периферическую кровь [8, 9].

Таким образом, поиск посредников, определяющих эффективность Г-КСФ-индуцированной мобилизации ГСК в периферическую кровь представляется актуальным для получения наиболее эффективного трансплантационного материала.

Материал и методы исследования

Материалом исследования служила периферическая кровь (ПК) 45 детей с онкогематологическими заболеваниями, находившихся на лечении в ФГУ «ФНКЦ ДГОИ» Росздрава с 2000 по 2006 годы. Из них 26 пациентов получали препараты Г-КСФ с целью восстановления количества гранулоцитов при медикаментозной цитопении, остальные 19 - с целью мобилизации CD34⁺ клеток в периферическую кровь для сбора и последующей аутологичной трансплантации. Кроме того, исследовали периферическую кровь и сыворотку 15 здоровых доноров ГСК, которые получали препараты Г-КСФ с целью мобилизации CD34⁺ клеток в периферическую кровь для дальнейшего отбора и последующей аллогенной трансплантации.

Протоколы клинического применения препаратов Г-КСФ

В настоящем исследовании использовались препараты Г-КСФ - граноцит (леногастрим), нейпоген (филгастрим) и лейкостим (филгастрим) - в рамках трех протоколов клинического применения Г-КСФ:

1. Мобилизация CD34⁺ клеток в периферическую кровь с целью их сбора для аллогенной трансплантации.
2. Мобилизация гемопоэтических стволовых клеток в периферическую кровь с целью их сбора для аутологичной трансплантации.
3. Лечение медикаментозной цитопении после курсов высокодозной цитотоксической полихимиотерапии у детей с онкологическими и онкогематологическими заболеваниями.

Получение СD34⁺ клеток периферической крови

Периферические CD34⁺ клетки получали с помощью процедуры цитафереза на гемосепараторе «Baxter CS-3000 Plus». Мононуклеарную фракцию клеток крови выделяли на градиенте гравитации. Процедуры цитафереза после периода мобилизации проводили ежедневно до тех пор, пока суммарное количество CD34⁺ клеток не достигало уровня, обеспечивающего наиболее быстрое приживление трансплантата. Минимально допустимым количеством CD34⁺ клеток для трансплантации считали их число более 2х10⁶/кг массы тела реципиента. Оптимальным считали количество CD34⁺ клеток более 5х10⁶/кг массы тела реципиента. Для достижения такого уровня требовалось различное число процедур цитафереза (от 1 до 4). Ежедневное введение препаратов Г-КСФ продолжали и в дни проведения сеансов цитафереза.

Определение колониеобразующей активности ГСК

Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции крови определяли двумя методами:

1. Культивирование в течение 14 суток в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.

• Эффективность клонирования определяли как общее число КОЕ на 1х10⁵ эксплантированных клеток.
• Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл ПК полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

2. Культивирование в полутвердой среде в системе «агаровая капля - жидкая среда» в течение 7 сут. с расчетом следующих показателей:

• Колониеобразующая (КОС) и кластерообразующая (КлОС) способность - число колоний (малые - 20-40 клеток, средние - 41-100 клеток и большие - более 100 клеток) и кластеров (малые - 5-9 клеток, большие - 10-19 клеток) на 1х10⁵ эксплантированных клеток.
• Эффективность клонирования - общее число колоний и кластеров на 1х10⁵ эксплантированных клеток.
• Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл крови или костного мозга полученные величины эффективности клонирования умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови и на число миелокариоцитов в 1 мл костного мозга.

Определение количества субпопуляций лейкоцитов и стволовых клеток, несущих рецептор к ILB и Г-КСФ

Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клеток, несущих рецепторы к Г-КСФ (CD114) и IL8 (CDw128), определяли по экспрессии мембранных маркеров (CD - clusters of differentiation) в реакции прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD3, CD14, CD15, CD34, CD38, CD45, CD114, CDw128 «Becton Dickinson» (США) при помощи проточной цитометрии на приборе FACSCalibur «Becton Dickinson» (США).

Определение концентрации цитокинов и ферментов в сыворотке крови

Для количественного определения концентрации G-CSF, IL-8, MMP-9, MMP-2, TIMP-1, TIMP-2 в сыворотке крови проводилась реакция ИФА «сэндвич» типа. В качестве ферментных меток использовалась пероксидаза. В настоящем исследовании использовались следующие наборы реагентов:

«Human MMP-9 (total)», «Human/mouse MMP-2(total)», «Human TIMP-2» («Quantikine®» R&D Systems Inc., USA), «Human TIMP-1» (Biosource International Inc., USA), «Human IL-8 ELISA Кit II» (BD OptEIA™ BD Biosciences Pharmingen, USA).

Статистическая обработка

Статистическую обработку данных производили для вариационных рядов с параметрическим распределением с помощью однофакторного дисперсионного анализа и оценкой по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; для вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалла- Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Для оценки равенства долей использовали Z-тест. Корреляционный анализ проводили с использованием уравнений линейной регрессии и по методу Спирмена для рядов с непараметрическим распределением. При расчетах использовали программы Excel 2002 Pro, STATISTIКA for Windows 8.0, Biostat for Windows.

Результаты и обсуждение

Исследования последних лет, в основном на моделях с животными, показали, что Г-КСФ не оказывает прямого воздействия на гемопоэтические клетки-предшественники [10], а мобилизация ГСК является результатом действия «периферических» хемокинов, таких, как интерлейкин 8 (IL-8 или CXCL8), и ремоделирования матрикса и базальной мембраны энзимами матрикса, такими, как желатиназа-В (ММР-9) [11]. В настоящем исследовании показано, что до назначения Г-КСФ наименьший уровень IL-8 наблюдался в группе здоровых доноров (6,07±0,39 пг/мл), а наибольший - у доноров аутологичных стволовых клеток (485±158 пг/мл) (табл. 1).

Таблица 1. Концентрация IL-8 в сыворотке периферической крови до и после применения Г-КCФ (M±m)

В результате применения Г-КСФ концентрация IL-8 в сыворотке периферической крови статистически значимо нарастает во всех трех исследованных группах (см. табл. 1). Учитывая полученные результаты, мы изучили связь между концентрацией IL-8 перед началом курса Г-КСФ и кратностью его роста к моменту отмены, и оказалось, что статистически значимой связи этих признаков не наблюдается (табл. 2).

Таблица 2. Зависимость кратности роста концентрации IL-8 в сыворотке крови от его инициальной концентрации в сыворотке крови

Одними из основных участников процесса реализации мобилизирующего эффекта Г-КСФ на клетки-мишени, вероятно, являются матрикс-металлопротеиназы (ММР-9, ММР-2) и их естественные ингибиторы (TIMP-I и TIMP-II). Нами показано, что в результате применения Г-КСФ в сыворотке периферической крови как у больных, подвергшихся химиотерапевтическому лечению, так и у доноров гемопоэтических стволовых клеток происходит изменение концентрации ММР-9. Так, в группе медикаментозной цитопении начальная концентрация ММР-9 была наименьшей - 24,2±7,7нг/мл. В ответ на действие Г-КСФ она выросла до 826,5±180,37нг/мл, изменившись, таким образом, в 55,75±17,6 раза (p < 0,0001). Самое высокое содержание ММР-9 и до начала курса Г-ГСФ, и в момент его отмены наблюдалось в группе здоровых доноров (182,0±42,1 и 1358,2±261,3 нг/мл соответственно). Кратность роста при этом составила 8,3±2,1 раза (p < 0,0001). Меньше всего изменилась концентрация ММР-9 в группе доноров ауто- ГСК - в 3,94±1,24 раза (p = 0,043) (табл. 3).

Таблица 3. Концентрация ММР-9 в сыворотке периферической крови до и после применения Г-КCФ (M±m)

Учитывая выявленные статистически значимые изменения уровня ММР-9 в динамике Г-КСФ-мобилизации, мы изучили зависимость количества клеток периферической крови от роста ММР-9. Как показано в таблице 4, во всех исследованных группах отмечается выраженная зависимость роста количества гранулоцитов от увеличения концентрации ММР-9 в сыворотке крови. Зависимость роста количества моноцитов от нарастания концентрации ММР- 9 в сыворотке крови наблюдается у доноров аутологичных CD34⁺ клеток (коэффициент корреляции r = 0,954, p = 0,045) и у здоровых доноров (коэффициент корреляции r = 0,724, p = 0,048). В группе медикаментозной цитопении статистически значимой связи этих процессов не обнаружено. Проведенный корреляционный анализ по законам линейной регрессии показал, что рост лимфоцитов происходит вне зависимости от роста ММР-9.

Таблица 4. Зависимость роста количества гранулоцитов от роста концентрации MMР-9 в сыворотке крови

Учитывая связь роста количества клеток крови со степенью нарастания концентрации в сыворотке крови IL8 и MMP-9, можно предположить, что динамика сывороточной концентрации указанных цитокинов в результате использования препаратов Г-КСФ связана друг с другом. При исследовании взаимосвязи степени роста концентрации ММР-9 с повышением концентрации IL-8 показано, что прямая корреляционная связь имеется в группе доноров ауто-ГСК (коэффициент корреляции 0,963, p = 0,037) и здоровых доноров (коэффициент корреляции 0,621, p = 0,046). В группе медикаментозной цитопении такая зависимость имеется, хоть и статистически не значима.

Учитывая тот факт, что фермент MMP-9 имеет естественный ингибитор, мы определили концентрацию естественного ингибитора желатиназы-В - TIMP-I в сыворотке периферической крови в динамике мобилизации Г-КСФ. Из полученных данных хорошо видно, что в результате действия Г-КСФ концентрация TIMP-I в сыворотке не изменяется ни в одной из исследованных групп. Соотношение ММР-9 и ее тканевого ингибитора изменяется во всех группах за счет статистически значимого увеличения содержания ММР-9. В группе медикаментозной цитопении, когда Г-КСФ назначался больным при количестве нейтрофилов менее 500 в 1 мкл, это соотношение изменилось в наибольшей степени (кратность роста ММР-9/TIMP-I составила 58,39±28,54 раза, p=0,02).

Другим представителем семейства матрикс-металлопротеиназ, возможно, участвующим в Г-КСФ-опосредованной мобилизации ГСК, является ММР-2. Нами показано, что до назначения Г-КСФ концентрации ММР-2 в сыворотке крови здоровых доноров и в момент его отмены были самыми высокими: 174,5±111,5 нг/мл и 156±70 нг/мл соответственно, у доноров аутологичных CD34⁺ клеток концентрация ММР-2 в сыворотке крови составила 9,53±4,74 нг/мл. В результате мобилизации концентрация ММР-2 не изменилась. Содержание тканевого ингибитора ММР-2 (TIMP-II) в результате мобилизации также не изменялось.

В многочисленных исследованиях показано, что применение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора приводит к значительному повышению количества CD34⁺ клеток в периферической крови. Наши данные не стали исключением, но, учитывая вероятное участие IL8 и MMP-9 в процессе мобилизации ГСК под действием Г-КСФ было важно изучить влияние этих факторов на эффективность мобилизации.

Так как в ходе проведенных исследований выяснилось, что во всех исследованных группах происходит статистически значимое увеличение концентрации IL-8 и ММР-9 на фоне стимуляции Г-КСФ, то становится очевидным желание связать эффект мобилизации CD34⁺ клеток с изменением уровня выше названных факторов.

Оказалось, что во всех исследованных группах отмечается прямая корреляционная зависимость эффективности мобилизации CD34⁺ клеток от степени роста концентрации IL-8 в сыворотке крови (табл. 5).

Таблица 5. Зависимость эффективности мобилизации CD34⁺ клеток от роста концентрации IL-8 в сыворотке крови

От степени повышения концентрации ММР-9 в сыворотке крови зависит Г-КСФ индуцированная мобилизация CD34⁺ клеток в группе мобилизации ауто-ГСК и у здоровых доноров, в то время как при использовании Г-КСФ для лечения медикаментозной цитопении эффективность мобилизации не зависит от степени изменения концентрации ММР-9 (табл. 6).

Таблица 6. Зависимость эффективности мобилизации CD34⁺ клеток от роста концентрации MMР-9 в сыворотке крови

При изучении влияния повышения концентрации в сыворотке крови IL8 и MMP-9 под действием Г-КСФ на динамику количества клеток-предшественников гранулоцитарно-макрофагального ряда кроветворения (КОЕ-ГМ) показано, что степень прироста КОЕ-ГМ в периферической крови после применения Г-КСФ зависит от степени роста сывороточной концентрации IL8 и не зависит от ММР-9 (табл. 7, 8).

Таблица 7. Зависимость эффективности мобилизации КОЕ-ГМ от роста концентрации IL8 в сыворотке крови

Таблица 8. Зависимость эффективности мобилизации КОЕ-ГМ от роста концентрации MMР-9 в сыворотке крови

Таким образом, Г-КСФ, вероятно, не оказывает прямого воздействия на гемопоэтические стволовые клетки, реализуя свой эффект мобилизации CD34⁺ клеток через клетки- мишени, имеющие рецепторы к Г-КСФ, которыми являются нейтрофильные гранулоциты и, возможно, моноциты [1, 7, 12, 13]. 3ти клетки, в свою очередь, получив сигнал от Г-КСФ, инициируют выработку вторичных посредников, которыми могут быть другие цитокины (IL-8, IL-3, GM-CSF, SDF-1) или ферменты (коллагеназы), которые разрушают связь CD34⁺ клеток со стромальными элементами костного мозга и усиливают миграцию CD34⁺ клеток в периферическую кровь.

В настоящем исследовании мы показали, что сывороточные концентрации IL-8 и ММР-9 значительно повышаются в результате использования Г-КСФ, причем степень этого повышения обратно пропорциональна их первоначальной концентрации. Концентрация другой матрикс-металлопротеиназы - ММР-2, также предполагающейся на роль посредника в реализации мобилизующего действия Г-КСф, в результате его использования не меняется. Не меняется и концентрация в сыворотке естественных ингибиторов ММР-9 и ММР-2 - TIMP-I и TIMP-II. Таким образом, из наших данных следует, что эффективность мобилизации как гранулоцитов, так и ГСК зависит от степени повышения сывороточной концентрации IL-8 и ММР-9.

* Материал представлен на международный симпозиум «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантации», Москва, ЦИТО, 25-26 апреля 2007 г.

About the authors

E. V. Raikina

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

S. A. Rumyantsev

Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

References

Supplementary files