Use of bone marrow stromal cells on Biosytall granules to plasty of skull bones

Full Text

Введение

Лечение дефектов костей черепа остается актуальной проблемой современной травматологии и нейрохирургии. Данные кости имеют низкие регенераторные свойства, следствием чего является снижение возможности гисто- и органотипического восстановления в случаях повреждений [1-3].

По современным данным, черепно-мозговые травмы мирного времени составляют до 40% от всех травм, причем до 40% из них сопровождается формированием дефектов, нуждающихся в оперативном лечении [4]. По результатам анализа санитарных потерь во время Великой Отечественной войны и войны в Республике Афганистан (РА) ранения головы составляли соответственно 14,8% и 22,6% [5]. Причем, в РА 46,5% и 32,9% ранений черепа приходились на лобную и теменную области соответственно, то есть на отделы мозгового черепа [6]. В вооруженных конфликтах в Чеченской Республике количество раненых и пострадавших с повреждениями черепа колебалось от 68,9 до 76,2% среди всех раненых нейрохирургического профиля [7].

Имеющиеся в арсенале нейрохирургов методы пластики дефекта при помощи синтетических материалов (различные пластмассы) обладают рядом недостатков. Среди них следует отметить экзотермический эффект при полимеризации, что приводит к дополнительному повреждению тканей раны; канцерогенное действие; относительную хрупкость, ведущую к повторным переломам [3]. Альтернативой этому является аллопластика трупной костью, костной крошкой,

костным регенератом, пластика фрагментом живой аутокости с дальнейшей его дистракцией [2, 3, 8, 9]. Вместе с тем, данная проблема далека от своего окончательного разрешения. В последнее время дискутируется возможность краниопластики с использованием культивированных остеогенных клеток [10-12].

В качестве носителей для остеогенных клеток предложены различные субстанции: альгинаты [13], гидроксиапатит, трикальцийфосфат и иные керамические материалы [14-16], деминерализованная костная ткань [17, 18]. Перспективным представляется использование в качестве носителя пористых имплантатов из стеклокристаллических материалов, в том числе и биоситалла [19]. Получены положительные результаты по остеоинтегративным свойствам имплантатов из этого материала [20].

Материал и методы

В качестве источника стромальных клеток использовали красный костный мозг, заключенный в крыльях подвздошных костей. Для получения материала животных (кроликов) после премедикации (0,5 мл 2% раствора димедрола, 1,0 мл 50% раствора анальгина в/м) фиксировали к станку. Удаляли шерсть в проекции крыльев подвздошных костей. Операцию выполняли под местным обезболиванием 0,25% или 0,5% раствором новокаина. Резецировали крылья подвздошных костей у подвздошно-позвоночного угла так, что удаленный фрагмент кости имел площадь не менее 1 см².

Манипуляция выполнялась с обеих сторон. Кусочки помещались в питательную среду DMEM (ISN, США) без сыворотки. Осуществляли гемостаз, рану послойно ушивали.

Из резецированных фрагментов костей тщательно выскабливали костный мозг. Полученную гомогенную тканевую массу центрифугировали в течение 10 мин. при 1000 оборотах. Для диссоциации костномозговых клеток применяли трехкратную последовательную щадящую ферментативную обработку осадков смесью трипсин-версен (Difco, США) при 37^oС. Далее фермент нейтрализовали сывороткой. Клеточную взвесь фильтровали через капроновый фильтр.

Клетки высевали в одноразовую пластиковую посуду (чашки Петри) из расчета 5-7х10⁵ клеток на 1 см² площади дна. Среда имела следующий состав: DMEM (ISN, США) и F12 (ISN, США) в соотношении по объему 3:1 с добавлением 20% эмбриональной сыворотки коров (ISN, США), гентамицина сульфата (50 мкг/мл). Культивирование происходило в СО₂-инкубаторе при концентрации углекислого газа 5% при 37^oС. Смену среды производили каждые 3 сут. Первый пересев осуществляли по достижении монослоя. После первого пассажа с целью индукции направленной остеогенной дифференцировки в среду добавляли L-аскорбат (0,2 мМ), b-Nа-глицерофосфат (10 мМ) и дексаметазон в количестве 10^-8 М.

Гранулы биоситалла размером 0,3-1,0 мм, представляющие собой фракцию препарата «Биосит», многократно промывали средой без сыворотки, стерилизовали автоклавированием и до использования хранили в среде без сыворотки.

Культивирование клеток на гранулах осуществляли в 24-х луночных платах. На дно укладывали гранулы так, чтобы оно было покрыто ими в слой. В каждую лунку вносили 10⁶ клеток культуры. Первую смену среды осуществляли через 3 сут. Общий срок культивирования на гранулах составлял 10 сут.

Кроликам, от которых был получен костный мозг, в дальнейшем выполняли дефект теменной кости. С соблюдением правил гуманного обращения с животными, послойно рассекали кожу, подкожную клетчатку, апоневротический шлем. Нагнетанием раствора анестетика и распатером отслаивали и отодвигали надкостницу. При помощи корончатой фрезы латеральнее сагиттального шва формировали фрезевое отверстие диаметром 1,0 см так, чтобы не повреждать твердую мозговую оболочку. Выполняли гемостаз. В образовавшийся дефект помещали гранулы костнопластического материала с мобилизованными на его поверхности клетками. Над материалом тщательно ушивали апоневротический шлем. Кожную рану ушивали наглухо.

Через 60 и 120 сут. после операции материал, включавший фрагменты костей, твердую мозговую оболочку, апоневротический шлем, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, а кусочки, предназначенные для изготовления препаратов для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), в 2,5% растворе глутарового альдегида. После промывки от фиксатора в течение 8-12 ч в проточной воде материал декальцинировали в перенасыщенном растворе трилона-Б в термостате при 37оС. Достаточная деминерализация кусочка проходила за 20-30 сут. Далее изготавливали препараты для световой микроскопии по общепринятой схеме. Окрашивали гематоксилином по Майеру и эозином, а также по Маллори.

После фиксации кусочки для СЭМ подвергали комбинированной деорганификации. Сначала их инкубировали в 2,5% растворе трипсина при 37°С в течение 12 ч, затем в 5% растворе гипохлорида натрия - 30 мин. В дальнейшем препараты обезвоживали в ряду спиртов возрастающей концентрации, напыляли золотом и изучали в растровом электронном микроскопе JEOL JSM - 35С при ускоряющем напряжении 15 kV. Также при помощи СЭМ контролировали адгезию клеток к гранулам до пересадки.

Результаты

Установлено, что культура стромальных клеток костного мозга кроликов после индукции направленной остеогенной дифференцировки обладает способностью адгезироваться к поверхности гранул из биоситалла. При длительном культивировании они попадают и на дно культурального сосуда, где сохраняют свою обычную отростчатую и веретеновидную форму (рис. 1А). При перенесении таких гранул в коллагеновый гель и дальнейшем культивировании, они диффузно прорастают в гель, занимая все больший объем, и постепенно теряют связь с фрагментом биоситалла (рис. 1В). Следовательно, биоситалл не обладает выраженным угнетающим действием на культуру клеток. В его присутствии клетки сохраняют способность к пролиферации.

 

Рис. 1. Культура стромальных клеток костного мозга в присутствии гранул биоситалла: А - в монослое, х32; В - в коллагеновом геле, х50

 

В зависимости от рельефа поверхности гранулы клетки приобретали различную форму. На гладких, пологих поверхностях клетки распластывались, сохраняя при этом отростчатую форму (рис. 2). На неровных поверхностях материала клетки располагались рядами, покрывая его монослоем, при этом их отростки фиксируются на дополнительных точках, находящихся в иных плоскостях (рис. 3). В течение 10 сут. клетки покрывали монослоем практически все поверхности гранул.

 

Рис. 2. Культура стромальных клеток костного мозга на гранулах биоситалла: А - х400; В - х500. СЭМ

 

Рис. 3. Культура стромальных клеток костного мозга на гранулах биоситалла. х600. СЭМ

 

В области костной раны гистологическая картина через 60 сут. свидетельствовала о частичном зарастании дефекта костной тканью, при этом его размер уменьшился приблизительно на 2/3. Морфология регенерата была различной в краевых и центральных участках дефекта. Так, в области краев дефекта наблюдался активный процесс остеогенеза вокруг гранул биоситалла. Следует, однако, отметить, что ни в одном случае не удалось наблюдать плотного контакта новообразованной кости с гранулами. Напротив, между ними всегда сохранялась прослойка волокнистой соединительной ткани, иногда с собственными кровеносными сосудами (рис. 4А). Однако архитектоника трабекул свидетельствовала о том, что они образуются вокруг беспорядочно лежащих гранул (рис. 4В). Часть гранул оказались заключенными во вновь сформированную костную ткань. Со стороны краев наблюдался активный центростремительный рост костной ткани даже в тех участках, которые были лишены биоситалла.

 

Рис. 4. Репаративный остеогенез в области дефекта теменной кости через 60 сут. после пересадки культуры стромальных клеток на гранулах биоситалла: А - х400; В - х250; бс - гранулы биоситалла. Стрелкой указаны кровеносные сосуды. Окраска: по Маллори

 

Часто гранулы, находящиеся ближе к краю дефекта, были окружены богатой клеточными элементами тканью, которую в патогистологической литературе принято называть «остеогенной» (рис. 5А). В центральных участках дефекта гранулы были окружены в основном соединительной тканью с мощно развитым волокнистым компонентом. Часть коллагеновых фибрилл была плотно упакована и демонстрировала слабые признаки минерализации, что выявлялось при окраске по Маллори (рис. 5В).

 

Рис. 5. Гранулы биоситалла в области дефекта теменной кости через 60 сут.: А - вблизи края дефекта, х400; В - в центральной части дефекта, х400. Окраска: А - гематоксилин и эозин; В - по Маллори

 

По данным СЭМ к 60 сут. костная ткань занимала не менее 2/3 дефекта. Ее граница с исходной костью прослеживалась четко (рис. 6А). Новообразованная ретикулофиброзная костная ткань имела неровную поверхность и большое количество отверстий, каналов и полостей, в которых залегали гранулы биоситалла, обнаженные в результате деорганификации (рис. 6В, С).

 

Рис. 6. Структура костного регенерата в области дефекта теменной кости через 60 суток после пересадки культуры стромальных клеток на гранулах биоситалла: А - стрелкой указана граница края дефекта и новообразованной костной ткани, х50; В, С - стрелкой указаны гранулы биоситалла в порах новообразованной костной ткани, х250. СЭМ

 

Через 120 сут. после пересадки клеток на гранулах биоситалла целостность теменной кости была восстановлена полностью. Бывшая область дефекта заполнена ретикулофиброзной костной тканью, формирующей костные трабекулы, расположенные между гранулами материала. Следует отметить, что со стороны твердой мозговой оболочки и надкостницы уже была сформирована кость пластинчатого строения. Общие костные пластинки составляли наружную и внутреннюю поверхности бывшего регенерата (рис. 7А). В самой кости происходили процессы ремоделирования - перестройки ретикулофиброзной костной ткани в пластинчатую.

 

Рис. 7. Структура регенерата в области дефекта теменной кости через 120 сут. после пересадки культуры стромальных клеток на гранулах биоситалла: А - общий вид, х70; В - гранула биоситалла, окруженная минерализованными пластинками соединительной ткани, х150; окп - общие костные пластинки, формирующие наружный и внутренний компактные слои теменной кости. СЭМ

 

Немаловажным является тот факт, что пространство между костью и биоситаллом стало значительно уже. Вместе с тем, признаков резорбции биоситалла или непосредственного замещения его костной тканью выявить не удалось. Гранулы были окружены минерализованными пластинками соединительной ткани, которую можно интерпретировать как костную (рис. 7В).

Обсуждение

Использованный в работе в качестве носителя для клеток стеклокристаллический материал - биоситалл - может выполнять функцию доставки клеток в область дефицита костной ткани, то есть использоваться в качестве скаффолда (scaffold). Ранее показано, что биоситалл может служить источником необходимых элементов для минерализации волокнистого матрикса при остеогенезе, что доказано методами электроннозондового микроанализа у пациентов с имплантированными биоситалловыми блоками [20]. Немаловажно, что биоситалл не только не подавляет пролиферацию и дифференцировку находящихся на нем клеток, но и способствует этим процессам. Установлено, что при культивировании остеогенных клеток на биоситалле почти в два раза увеличивается удельная активность щелочной фосфатазы, что свидетельствует об их прогрессивной остеогенной дифференцировке [21, 22].

При трансплантации культивированных стромальных клеток на носителе в рану возникают обоснованные сомнения относительно сохранения ими жизнеспособности в области активного воспаления и действия различных цитокинов. В некоторых работах показано, что данные клетки сохраняют жизнеспособность и прямо или опосредованно участвуют в процессах остеогенеза [23, 24].

Значимость использования данной методики для оптимизации процессов остеорепарации или пластики костей следует оценивать в сравнении с теми же процессами, происходящими естественным образом.

О сниженном регенераторном потенциале покровных костей черепа известно давно. Так, по данным различных авторов восстановление дефекта теменной кости у кролика либо не происходит вообще, либо происходит частично [2, 25]. Результаты наших экспериментов показывают, что этот процесс может быть существенно ускорен. При использовании биоситалла в качестве носителя клеток данный процесс по срокам наступления полного восстановления целостности кости происходит быстрее, чем при использовании взвеси клеток или клеток в коллагеновом носителе. Так, по нашим данным, при трансплантации взвеси стромальных клеток в аналогичный дефект формирование полноценного костного регенерата наблюдается лишь на 120 сут., а в коллагеновом геле - на 90 [23], в то время как по результатам настоящего эксперимента восстановление целостности костной ткани произошло в период от 60 до 120 сут. При этом следует предположить, что сформированный в результате трансплантации клеток в культуральной среде или коллагене регенерат отличается по прочности от регенерата с гранулами биоситалла, поскольку в этом случае в структуру костной ткани инкрустированы гранулы биоситалла, достаточно плотно охваченные костными трабекулами. Необходимо также отметить и более полное восстановление анатомических контуров теменной кости.

Не следует забывать тот факт, что, несмотря на сниженный регенераторный потенциал, плоские кости черепа остаются весьма подверженными к индукции остеогенеза [23]. Реализация индукционного воздействия выражается в изменении временного соотношения фаз посттравматической регенерации: первичной реакции на повреждение, репаративного остеогистогенеза и адаптивной перестройки [26, 27]. В плоских костях черепа репаративный процесс отличается тем, что фаза адаптивной перестройки протекает атипично. Результаты морфометрических исследований свидетельствуют, что именно на 60-120 сут. в регенерате наблюдается снижение доли костной ткани [28]. Такие манипуляции, как пересадка клеток, в том числе и на биоситалловых носителях, являются тем индуктором, которые пролонгируют фазу собственно репаративного остеогистогенеза и способствуют нормальному протеканию фазы адаптивной перестройки. Об этом свидетельствуют и полученные нами данные - признаки перестройки ретикулофиброзной костной ткани регенерата в пластинчатую, полностью восстановившего целостность кости через 120 сут. после формирования дефекта и пересадки клеток на гранулах биоситалла.

Является ли длительное сохранение биоситалла в костной ране препятствием или, наоборот, положительным моментом при замещении дефектов различной локализации, покажут будущие исследования. Однако уже сейчас ясно, что данный материал, как в чистом виде, так и в сочетании с культурой клеток в форме гранул пригоден лишь при строго определенных показаниях, например, при лечении костных кист и полостей различного происхождения. Искусственное расширение показаний, в том числе и при использовании клеточных технологий, преждевременно, что не исключает возможности рассматривать технологии совмещения материала-носителя, в том числе биоситалла, и клеток в качестве элемента, улучшающего остеоинтеграцию различных имплантатов.

Безусловно, дефекты костей иной локализации могут потребовать использования не гранулированного материала, а создания трехмерных конструкций, по характеру и степени открытости пор имитирующих нативную кость.

Результаты проведенного исследования могут стать предпосылкой и обоснованием дальнейшего поиска эффективных стратегий костной пластики, основанных на клеточных технологиях.

About the authors

R. V. Deev

Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, Saint-Petersburg

N. V. Tsupkina

Institute of Cytology, RAS

Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, Saint-Petersburg

N. S. Nicolaenko

Institute of Cytology, RAS

Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, Saint-Petersburg

G. P. Pinaev

Institute of Cytology, RAS

Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation, Saint-Petersburg

References

Supplementary files