MicroRNAs modulate the activity of embryonic stem cell pluripotency factors Nanog, Oct4 and Sox2

Full Text

МикроРНК - это короткие последовательности из 20-25 рибонуклеотидов, основной функцией которых является подавление трансляции определенных матричных РНК (мРНК), что приводит к остановке синтеза белка (1-2). В течение многих лет они привлекают интерес научного мира, являясь одним из основных регуляторов экспрессии генов. Считается, что микроРНК связываются с нетранслируемыми областями мРНК, расположенных на 3'-конце, что справедливо для большинства микроРНК (3, 4). Исключений из этого правила очень немного (5, 6). Вместе с тем вопрос о мишенях микроРНК остается крайне важным, так как детальное знание о механизмах их действия в каждом конкретном случае совершенно необходимо для понимания регуляции экспрессии генов, что неразрывно связано со всеми процессами, происходящими в клетке - как нормальными, так и патологическими.

Научная группа Y. Tay длительное время занимается изучением функциональных особенностей микроРНК. Именно в их лаборатории была предсказана возможность существования многочисленных специфических сайтов связывания микроРНК в пределах мРНК (7). В качестве модельных генов были выбраны nanog, oсt4 и soх2, которые кодируют три основных фактора плюрипотентности мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), а также определяют начало их дифференцировки (8-11). В своей последней работе авторы индуцировали дифференцировку ЭСК линии E14 с помощью ретиноевой кислоты и обнаружили, что при этом, спустя некоторое время, происходит существенное повышение количества в клетке лишь трех микроРНК из всех известных: miR-296, miR-470 и miR-134. Каждая из них, как было показано, связывается сразу с несколькими сайтами на мРНК белков Nanog, Oсt4 и Soх2, а именно:

• miR-296 имеет два комплементарных участка на мРНК Nanog;
• miR-470 связывается с шестью сайтами на мРНК Nanog и с тремя сайтами на мРНК Oсt4;
• miR-134 имеет пять последовательностей-мишеней на мРНК Soх2.

Такое количество сайтов связывания предполагает, что эти три микроРНК могут регулировать процессы поддержания плюрипотентности и дифференцировки ЭСК в разных вариантах в зависимости от уровня их экспрессии и соотношений. Трансфекция ЭСК пре-miR-296, пре-miR-470 и пре-miR-134 по отдельности, то есть искусственное увеличение в клетках концентрации одной из микроРНК, приводила к резкому снижению синтеза соответствующего белкового продукта. Интересно, что в контрольных экспериментах исследователи провели двойную трансфекцию дифференцированных клеток линии 293Т генами nanog, soх2 и oсt4 и соответствующими пре-микроРНК, показав, что в таком случае полностью дублируются события, происходящие в ЭСК. Трансфекция как ЭСК, так и клеток линии 293Т другими пре-микроРНК не влияла на экспрессию генов трех выбранных транскрипционных факторов. Внесение же мутаций в сайты связывания miR-296, miR-470 и miR-134 на мРНК Nanog, Oсt4 и Soх2 приводило к невозможности подавления трансляции, и в клетке обнаруживались белковые продукты интересующих генов.

Основной вопрос, однако, оставался в индукции с помощью микроРНК дифференцировки ЭСК и изменения их морфологии. Раньше Y. Tay и соавт. было показано, что miR-134, подавляя экспрессию гена nanog, запускает дифференцировку ЭСК (12). Относительно же двух других микроРНК до настоящего времени ничего известно не было.

МикроРНК модулируют активность факторов плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток

Трансфекция ЭСК линии Е14 пре-miR-296 привела к повышению экспрессии следующих маркеров дифференцировки: Fgf5, Soх1, Miхl1 и Kdr. В присутствии ретиноевой кислоты такая трансфекция также приводила к ускорению запуска экспрессии эктодермальных маркеров Soх1, Fgf5 и Otх2, резкому снижению экспрессии Nanog, а также некоторому снижению количеств мРНК белков Oсt4 и Soх2. В течение трех суток после трансфекции клетки приобретали характерные для дифференцирующихся в эктодермальном направлении ЭСК черты, распластывались по субстрату, лишались способности к синтезу щелочной фосфатазы и способности формировать колонии. При этом, что весьма логично предположить, двойная трансфекция клеток пре-miR- 296 и мутантным геном nanog, чья мРНК не имеет сайтов связывания микроРНК, позволяла ЭСК сохранить плюрипотентность и способность к самообновлению, равно как и их морфологические характеристики.

Точно также трансфекция пре-miR-47О приводила к изменению фенотипа ЭСК через трое суток, снижению экспрессии щелочной фосфатазы и повышению экспрессии несколько иного спектра эктодермальных дифференцировочных маркеров, а именно Fgf5, Nes и Otх4.

При блокировании в ЭСК функционирования микроРНК, клетки практически переставали реагировать на индукцию дифференцировки с помощью ретиноевой кислоты.

Эту работу можно по праву назвать выдающейся: авторы провели несколько серий весьма убедительных экспериментов с большим количеством контрольных опытов, показав, что микроРНК играют ключевую роль в дифференцировке ЭСК и, таким образом, являются факторами, регулирующими процесс эмбрионального развития на самых ранних его этапах. Связываясь с большим числом сайтов на мРНК помимо консервативных последовательностей в ее 3'-области, они могут осуществлять сложные взаимодействия со своими мишенями, реализуя, по-видимому, видоспецифическую программу развития ЭСК.

В последний год по данным US Рubliс Library of Mediсine (13) по изучению микроРНК было проведено более тысячи работ в самых разных областях - от биологии старения и фундаментальных вопросов эмбриогенеза, до онкологии и других клинических направлений. Видимо, в последующие несколько лет интерес к этим небольшим молекулам не ослабнет, так как их роль в решении фундаментальных и прикладных проблем биологии и медицины очевидна.

About the authors

A. S. Grigoryan

Author for correspondence.
Email: bozo.ilya@gmail.com

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. MicroRNAs modulate the activity of pluripotency factors in embryonic stem cells

Download (101KB)

Indexing metadata