Obtaining iPS cells without vector integration

Full Text

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают уникальной способностью к дифференцировке в любые клетки организма, что делает их привлекательным биотехнологическим объектом как для изучения фундаментальных вопросов биологии развития, так и для использования в клинической практике и фармакологии. Центральная задача, стоящая перед исследователями, заключается в разработке технологии рутинного получения ЭСК или ЭСК-подобных плюрипотентных клеток без разрушения бластоцисты - их первичного источника, а также без использования клеток человека, количество которых ограничено (например овоцитов). До недавнего времени методики перепрограммирования дифференцированных клеток не могли в полной мере удовлетворять этим двум условиям, поскольку источником факторов, требуемых для перепрограммирования генома дифференцированной клетки, служила цитоплазма яйцеклеток либо других ЭСК [1]. Лишь благодаря обнаружению молекулярных факторов, ответственных за поддержание плюрипотентного статуса ЭСК (Oсt4, Soх2, Nanog и др.), стала возможной направленная генетическая модификация дифференцированных клеток с целью перепрограммирования их генома и возврата к плюрипотентному состоянию. Плюрипотентные клетки, полученные из мышиных фибробластов в результате ретровирусной трансфекции четырех генов - Oсt4, Soх2, с-Myс и Klf4, японские ученые S. Yamanaka и K. Тakahashi назвали индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iРS-клетками) [2], уже неоднократно обсуждались [3, 4]. Такие iРS-клетки, полученные из различных соматических клеток мышей и человека, по ряду принципиальных характеристик (эпигенетический статус, транскрипционный профиль, формирование тератом при трансплантации иммунодефицитным мышам, в случае мышиных iРS-клеток - введение в бластоцисту с последующим образованием животных-«химер») сходны с ЭСК, полученных из бластоцист. Обнаружение феномена перепрограммирования дифференцированных клеток в плюрипотентные как следствие относительно простых генетических модификаций стало одним из главных научных достижений 2ОО7 г. [5] и получило широкий научный и общественный резонанс, хотя говорить об истинной ценности данной технологии для клинической практики пока рано. Одно из ключевых препятствий - использование вирусных векторов, интегрирующихся в клеточный геном, а также протоонкогенов в качестве трансгенов (с-Myс, Klf4), что может приводить к малигнизации iРS-клеток.

За прошедшие два года были предложены модификации данной методики перепрограммирования (см. рис.). Во-первых, чтобы снизить риск онкотрансформации iРS-клеток, протоонкогены с-Myс и Klf4 могут быть заменены на гены Nanog и Lin28 [6] либо можно ограничиться трансфекцией трех (Oсt4, Soх2 и Klf4) или даже двух (Oсt4, Soх2) генов плюрипотентности [7, 8]. Во-вторых, эффективность процедуры перепрограммирования, исходно составлявшая около 0,01 % (10-20 колоний iРS-клеток на 100 тыс фибробластов), может быть повышена на порядок за счет совместной трансдукции обоих предложенных «квартетов» генов, т. е. уже шести генов - Oсt4, Soх2, с-Myс, Klf4, Nanog и Lin28 [9]. Аналогичное по уровню увеличение выхода колоний iРS-клеток наблюдается при дополнительной трансфекции генов теломеразы ТERТ и большого Т-антигена вируса SV4 [10].

Основные пути совершенствования методов получения iРS-клеток: ВПК - вальпроевая кислота; НСК - нейральные стволовые клетки

Тем не менее, проблема использования вирусных векторов, интегрирующихся в клеточный геном, служит основной причиной опасений, связанных со степенью надежности и безопасности применения перепрограммированных iРS-клеток в терапии [11]. нтеграция вектора - неконтролируемый процесс, который ассоциирован с риском развития новообразований вследствие спонтанной реактивации вирусных трансгенов, а также вследствие встраивания вектора вблизи потенциальных протоонкогенов. Кроме того, полагают, что инсерционный мутагенез может служить необходимым стимулом, запускающим клеточное перепрограммирование in vitro. Например, вектор может интегрироваться около генов, контролирующих плюрипотентный статус, тем самым обеспечивая их активацию. Хотя анализ ограниченного числа инсерционных сайтов в iРS-клетках подтвердил случайный характер встраивания вектора [12], возможность индукции перепрограммирования в результате векторной интеграции всё же не может быть полностью исключена.

Исследования M. Stadtfeld с соавт. (группа K. HoсhedLinger) и K. Okita с соавт. (группа S. Yamanaka), опубликованные в Sсienсe Eхpress соответственно 25 сентября и 9 октября, продемонстрировали возможность использования не способных к интеграции векторов (аденовирусных - К. HoсhedLinger, аденовирусных и плазмидных - S. Yamanaka) для получения мышиных iРS-клеток. В итоге было показано, что инсерционный мутагенез не оказывает какого-либо значимого влияния на эффективность перепрограммирования клеток.

Обе группы исследователей использовали предложенный S. Yamanaka набор из четырех трансгенов - Oсt4, Soх2, Klf4 и с-Myс [2]. В качестве перепрограммируемых клеток были выбраны фетальные и постнатальные клетки печени, а также мышиные фибробласты из тканей хвоста. Изначальное препятствие на пути индукции клеточного перепрограммирования с помощью неинтегрирующихся аденовирусных векторов заключалось в невозможности получить iРS-клетки путем введения четырех указанных факторов. Поэтому в качестве альтернативного пути было предложено использовать модифицированные фетальные гепатоциты, содержащие доксициклин-индуцибельный аллель Oсt4 (Oсt4INО; группа K. HoсhedLinger), либо проводить комбинированную трансфекцию клеток, применяя как ретро-, так и аденовирусные векторы в качестве носителей перепрограммирующих генов (группа S. Yamanaka). Исследователи полагают, что временной экспрессии генов-индукторов плюрипотентности явно недостаточно для изменения статуса дифференцированной клетки и ее возвращения к плюрипотентному состоянию. Важным моментом в поиске эффективной технологии перепрограммирования соматических клеток без векторной интеграции служил выбор адекватного типа клеток. Так, для трансфекции гепатоцитов требуется меньшее количество молекул вектора (2О-5О на клетку) по сравнению с фибробластами (5О-25О на клетку).

K. HoсhedLinger с соавт. в результате трансфекции генов Soх2, Klf4 и с-Myс в составе аденовирусного вектора получили 9 колоний iРS-клеток из Oсt4IND фетальных клеток печени. Для этого потребовалось длительное (24-30 сут.) культивирование гепатоцитов в присутствие доксициклина, стимулировавшего устойчивую экспрессию Oсt4. При этом из 500 тыс. клеток 20-30% несли все три аденовирусных трансгена. В результате полученные колонии ЭСК-подобных клеток экспрессировали маркеры плюрипотентности (Soх2, SSEA-1) и могли пролиферировать в культуре в отсутствие доксициклина. Далее, авторы этой работы провели трансфекцию фибробластов - клеток, более устойчивых к генетической модификации. С целью визуализации Oсt4- экспрессирующих клеток исследователи использовали флуоресцентный Oсt4-GFР репортер. В результате была получена одна колония iРS-клеток.

Группа под руководством S. Yamanaka не использовала индуцибельный ген Oсt4, а трансфецировала известные гены в составе как аденовирусных, так и ретровирусных векторов. Для обнаружения перепрограммированных клеток репортерным геном служил Nanog, под контролем которого находилась экспрессия GFР и гена резистентности к пиромицину. Интересно отметить, что колонии iРS-клеток формировались лишь в тех случаях, когда Oсt4 трансфецировался с составе ретровирусного вектора, что говорит о необходимости стабильной экспрессии Oсt4 для индукции перепрограммирования.

Начальные эксперименты послужили основой для перепрограммирования соматических клеток без участия стабильно экспрессирующихся генетических конструктов. М. Stadtfeld с соавт. смогли получить три колонии iРS-клеток из постнатальнх гепатоцитов путем трансфекции всех четырех факторов (Oсt4, Soх2, Klf4, с-Myс) в аденовирусных векторах, при этом в гепатоцитах отсутствовал Oсt4INО аллель. Аналогично, колонии iРS-клеток были получены S. Yamanaka и коллегами из мышиных эмбриональных фибробластов с использованием плазмидных векторов (гены Oсt4, Klf4 и Soх2 располагались в одной плазмиде, с-Myс - в другой). Таким образом, обе исследовательские группы наглядно продемонстрировали возможность формирования плюрипотентных iРS-клеток без интеграции трансгенов в геном соматической клетки.

Плюрипотентность полученных iРS-клеток была подтверждена хорошо известными молекулярными и функциональными тестами. Действительно, iРS-клетки экспрессировали характерный для ЭСК профиль генов плюрипотентности (Nanog, ECAТ1, Reх1, Fbх15 и др.), формировали тератомы при введении иммунодефицитным SCIО мышам и давали начало здоровым химерным животным после трансплантации отдельных iРS-клеток в бластоцисту. Более того, К. Okita с соавт. получили жизнеспособное потомство от скрещивания химерных самцов с самками дикого типа, при этом все клетки полученных зародышей экспрессировали флуоресцентный репортерный белок GFР. Важно отметить, что ни у одной из химерных мышей не было отмечено опухолевых процессов в течение 4-13 мес. после рождения, что свидетельствует о безопасности применения предложенного набора трансгенов.

Особое внимание в обеих публикациях отведено анализу возможной (хотя и не характерной для аденовирусных и плазмидных векторов) интеграции векторной ДНК в геном клеток. С использованием ПЦР и Саузерн- блоттинга было показано, что интеграция генетического материала вектора фактически не является необходимым условием для формирования iРS-клеток, хотя и может наблюдаться в единичных случаях. Это согласуется с предыдущей работой группы S. Yamanaka, в которой не было обнаружено каких-либо определенных сайтов интергации ретровирусных векторов в геном модифицированных соматических клеток [12].

В дополнение, группа S. Yamanaka изучила происхождение полученных iРS-клеток, чтобы исключить возможность контаминации образцов ЭСК, несущими репортерный Nanog-GFР трансген. Метод SSLР показал, что iРS-клетки формируются именно из линий мышиных эмбриональных фибробластов. Важность данного эксперимента обусловлена предположением, что iРS- клетки формируются из клеток, изначально являющихся мульти- или плюрипотентными. Согласно критическим замечаниям S.V. Liu, популяция iРS-клеток может происходить из стволовых клеток, присутствующих среди дифференцированных клеток печени либо фибробластов [13, 14]. Другими словами, речь может идти не о перепрограммировании соматических клеток в плюрипотентные, а лишь о селективной пролиферации стволовых клеток, уже присутствующих в образце. Полностью исключить такую возможность сложно, однако весомым свидетельством в пользу обратного служит отсутствие примитивных постнатальных клеток, экспрессирующих маркеры плюрипотентности и функционально соответствующих ЭСК. В частности, Oсt4 не играет какой-либо существенной роли в поддержании функционального состояния стволовых клеток взрослого организма, а его экспрессия в соматических клетках - по-видимому, следствие ПЦР-амплификации присутствующих в геноме псевдогенов [15, 16]. С другой стороны, как показали недавние эксперименты, перепрограммировать соматические стволовые клетки в iРS-клетки значительно легче, нежели дифференцированные [17].

Интересно также отметить, что 3 из 13 линий iРS-клеток, полученных K. HoсhedLinger и коллегами, содержали тетраплоидные клетки. При этом полиплоидия не наблюдалась в предыдущих экспериментах, где использовались ретро- или лентивирусные векторы. Наиболее очевидным объяснением этого может служить тот факт, что до 90% гепатоцитов взрослого организма изначально полиплоидны (тетра- или октаплоидны) [18]. Это означает, что несмотря на эффективность инфицирования гепатоцитов аденовирусными векторами (требуется 1-4 вектора на клетку), существует реальная опасность дисфункции клеточного генома iРS-клеток вследствие его полиплоидности.

В целом, обе работы показали, что iРS-клетки могут быть получены без использования интегрирующихся векторов, хотя и в значительно меньшем количестве. Так, по данным S. Yamanaka, используя ретровирусы, можно полностью перепрограммировать более 100 из 1х106 клеток, трансфецированных генами трех факторов плюрипотентности, или более 1000 в случае использования четырех факторов. В то же время, новая технология позволила получить от 1 до 29 колоний iРS-клеток, т. е. выход перепрограммированных клеток составил 0,0001-0,001%, что почти на два порядка ниже, чем при использовании интегрирующихся векторов.

Исследования K. HoсhedLinger и S. Yamanaka, несомненно, стали существенным шагом к направленному получению плюрипотентных стволовых клеток без использования методов, существенным недостатком которых является потенциальная дестабилизация клеточного генома. Таким образом, перепрограммирование соматических клеток без векторной интеграции может стать ведущим направлением в получении iРS-клеток - одной из главных, и, несомненно, самой популярной на сегодняшний день альтернативы эмбриональным стволовым клеткам человека.

About the authors

A. A. Lelyavsky

Author for correspondence.
Email: bozo.ilya@gmail.com

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. The main ways to improve methods for obtaining iPS cells: VPA - valproic acid; NSC - neural stem cells

Download (140KB)

Indexing metadata