Paravulnar tissues - a new source of MMSC?

Full Text

Применение достижений клеточных технологий в клинической практике возможно лишь при удовлетворении ряда требований, касающихся получения клеточного материала, безопасности и воспроизводимости результатов в клинической практике. В этой связи, активно исследуются методы и источники получения исходных клеточных популяций, их спецификации, особенности и свойства в экспериментах in vitro и in vivo.

Несмотря на идентификацию сходных с ММСК клеток в различных тканях и органах [1], их выделение осуществляется главным образом из красного костного мозга и жировой ткани, где их количество наибольшее, а процедура получения достаточно безопасна. Однако возможность осуществления инвазивных манипуляций для выделения ММСК ограничена тяжестью состояния пациента, которому в дальнейшем будет необходима клеточная терапия. В частности, в случае тяжелых повреждений опорно-двигательного аппарата дополнительные травмирующие мероприятия, связанные с получением костного мозга или жировой ткани, становятся неприемлемыми, выделение клеточного материала откладывается. Более того, экспериментально доказано, что костный мозг животных, перенесших политравму, содержит меньшее количество гемопоэтических стволовых клеток [2] чем в состоянии физиологической нормы; подобное обстоятельство связано с их мобилизацией из костного мозга при травме на периферию. С определённой уверенностью можно экстраполировать это и на численность ММСК. В этой связи, в сочетании с идентификацией и изучением источников ММСК продолжается разработка и совершенствование протоколов их получения.

В рамках этого направления особый интерес представляют недавно опубликованные в журнале Вone and Joint Surgery результаты исследования L.J. Nesti с соавт., нацеленные на использование в качестве источника ММСК тканей, удаляемых в процессе хирургической обработки ран.

В клиническом исследовании приняли участие 1О солдат армии США с ранами конечностей, в том числе и множественными, полученными во время боевых действий в раке. Пострадавшие были доставлены в армейский медицинский центр олтера Рида (Вашингтон, США), на базе которого осуществлялась работа. В результате серийных хирургических обработок ран, нацеленных на удаление поврежденных «мягких тканей» и костных осколков из зон первичного и вторичного травматического некроза, был собран материал, использованный с согласия пациентов для дальнейших клеточных исследований.

Методика выделения клеток включала гомогенизацию мышечной ткани в культуральной посуде с добавлением ОMEM, антибиотиков (пенициллин 300 Е/мл и стрептомицин 300 мг/мл) и фунгизона в высоких концентрациях для ликвидации микробного загрязнения. Затем материал помещался в среду, обладающую протеолитическими свойствами за счет наличия коллагеназы II типа в концентрации 0,5 мг/мл, где выдерживался в течении 2 час. После этапов фильтрации и центрифугирования клетки высевались на поверхность культуральной посуды. Особенностями технологии инкубирования, на которые акцентировали внимание авторы, являлось промывание культуры раствором Хенкса непосредственно перед сменой среды для более быстрого очищения от неспособных к адгезии мононуклеаров, а также использование высоких концентраций антибиотиков и противогрибкового препарата, что, однако, не предотвратило потерю двух из двенадцати культур из-за микробной контаминации.

Исследователи подсчитали, что с одного грамма мышечной ткани было получено 7,1±6,4х106 жизнеспособных клеток, из которых 26,4%±3,6% адгезировались к поверхности культурального пластика, принимая удлиненную веретеновидную форму, и начали пролиферировать со второго дня инкубирования. Через две недели культура достигла 80-90% конфлюэнтности. На втором этапе исследования проводилась детальная спецификация культуры в соответствии с основными критериями ММСК [3]. Методом проточной цитометрии была показана экспрессия CD73, CD90 и CD105 в сочетании со сниженной продукцией CD45. Клетки были также позитивны по маркерам CD29, CD44, CD146, что соответствует иммунофенотипу ММСК. Кроме того, была показана способность полученных клеток к дифференцировке в трех ортодоксальных направлениях: остеобластическом, хондробластическом и адипоцитарном. При стимуляции остеогенеза наблюдалось повышение содержания щелочной фосфатазы в культуре и преципитация солей кальция. Доказательством хондрогенеза послужила идентификация гликозаминогликанов посредством окрашивания альциановым синим. При дифференцировке в адипоцитарном направлении определялось внутриклеточное накопление липидных капель. Для более полного подтверждения дифференцировочных потенций полученных клеток исследователи методом ПЦР с обратной транскрипцией показали экспрессию ряда генов, специфичных для представителей каждого отдельного направления дифференцировки. Клетки при культивировании в остеоиндуктивной среде экспрессировали CВFA1/RUNX2 (сore binding faсtor a1), а также гены, ответственные за синтез щелочной фосфатазы и остеокальцина. В адипоцитарной среда стимулировала экспрессию РРARg2 (peroхisone proliferator-aсtivated reсeptor g2), LРL (lipoprotein lipase) и FAВР4 (fatty aсid binding protein 4). В хондрогенных условиях увеличивался уровень экспрессии SOX9 и генов, кодирующих синтез коллагена II типа и аггрекана.

Важно отметить, что исследователи не первыми выделили стволовые клетки из поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани. Первые работы датируются концом 90-х, началом 2000-х. Тогда, главным образом, были описаны стволовые клетки, обладающие гемопоэтическими потенциями и способностью к миогенной дифференцировке [4-6]. Некоторые авторы рассматривали их в качестве предшественников сателлитных клеток, коммитированных в рабдомиоцитарном направлении. В экспериментах на мышах Qu-Рetersen с соавт. (2002) описали CD34+/Sсa-1+клетки, обладающие высокой пролиферативной активностью и способные к дифференцировке в эндотелиальном и нейральном направлениях. A. Saссo (2008) с соавт. описали мышечные стволовые клетки (CD34+/integrin-α7+), не экспрессирующие Sсa-1 и характеризующиеся высоким уровнем экспансии in vivo. Было показано, что при трансплантации в скелетную мышечную ткань, лишённую сателлитных клеток, они занимали их клеточные ниши, активно пролиферировали и дифференцировались в Рaх7+ мононуклеары, участвующие в миогенезе. Однако ни в одной из множества противоречивых работ, касающихся получения разнообразных клеток-предшественниц из поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани, ранее не была выполнена подробная спецификация полученных культур.

Таким образом, L.J. Nesti с соавт. впервые в клиническом исследовании описали получение стволовых клеток из травмированной скелетной мышечной ткани, доказали их принадлежность к популяции ММСК за счет установления способности к адгезии к поверхности культуральной посуды, характерного иммунофенотипа и дифференцировки в трех ортодоксальных направлениях. Основным нерешённым вопросом остались источники появления ММСК в поврежденных мышцах. Потенциально возможны несколько вариантов, частично указанных авторами работы. Во-первых, ММСК могли мигрировать в область поражения непосредственно из костного мозга поврежденных костей. Во-вторых, ММСК могут быть привнесены из кровеносного русла, где установлено наличие соответствующих им по ряду морфофункциональных свойств циркулирующих предшественников соединительных тканей [7, 8]. В-третьих, ММСК в виде периваскулоцитов, в соответствии с теорией «мезенхимального резерва», могут сопровождать мелкие сосуды [9], которыми богата мышечная ткань. К тому же некоторые свойства ММСК описаны и для сателлитных клеток, как то адгезия к поверхности культурального пластика, остео- и адипогенные потенции [10, 11], что могло служить основой для непроизвольного включения их в состав выделенной популяции ММСК. становление источников появления ММСК в мышечной ткани имеет важное практическое значение. Если исследуемая популяция присутствовала в тканях травмированной конечности до ранения, то неизбежно в использованном для их получения материале эти клетки подверглись воздействию повреждающих факторов огнестрельного или минно-взрывного оружия, следовательно, находились в состоянии т. н. «молекулярного сотрясения», способного вызывать повреждения генетического аппарата клетки и запускать апоптоз. В этой связи в будущем необходим дополнительный и детальный анализ биологии этих клеток.

Кроме того, остается не совсем ясным, как авторам удалось при получении тканевого материала в поздние сроки от ранения (7 сут.) избежать попадания в культуру элементов грануляционной ткани, безусловно, богатой стволовыми клеточными элементами. Впрочем, эти детали не снижают общего значения работы, как основополагающей в новом направлении - клеточных технологиях в практике военно-полевой хирургии. В частности, Министерством Обороны США создан Институт Регенеративной Медицины Вооруженных Сил с целью разработки методов лечения солдат с повреждениями конечностей с помощью клеточных технологий. Возникновение этой программы обусловлено увеличением доли минно-взрывных поражений и ранений конечностей в условиях последних военных компаний армии США, что увеличило необходимость восстановления обширных участков конечностей у пострадавших. За правительственный грант в 250 млн $ соперничают большое количество научных групп и лабораторий [12]. В этой связи, есть основания полагать, что работа L.J. Nesti с соавт. также связана с участием в данной программе.

В любом случае, исследователи выявили принципиально новый источник получения ММСК в условиях тяжелого состояния пациента с травмами костно-суставной системы, объединяющий хирургию и клеточные технологии в единый инструмент оказания адекватной, комплексной медицинской помощи.

About the authors

I. Y. Bozo

Author for correspondence.
Email: bozo.ilya@gmail.com

References

Supplementary files