Technology of obtaining of embrional stem cells parthenogenetic lines in combination with a method of nucleus transfer

Full Text

Партеногенез - это процесс образования эмбриона из яйцеклетки, не оплодотворенной сперматозоидом. У некоторых животных этот процесс наблюдается в природе, но ни один вид млекопитающих не способен размножаться таким образом. Основные причины остановки развития - нарушение экспрессии генов из-за неправильной картины импринтинга [1]. Геномный импринтинг - одна из форм регуляции генной экспрессии, при которой транскрипция гена зависит от пола особи, от которой был получен аллель этого гена. Данная регуляция осуществляется посредством метилирования генов. При импринтинге уровень транскрипции некоторых генов определяется полом организма, от которого эти гены унаследованы. В этом случае вклады отцовского и материнского геномов в развитие организмов неодинаковы. Поэтому для нормального развития эмбриона необходим хромосомный материал особей разных полов [2]. В экспериментах на мышах партеногенезом удается получить зародыш из нескольких десятков клеток, очень редко эти эмбрионы развиваются дольше [3]. Впрочем, получение партеногенетического клона - не первостепенная задача ученых. Перспектива использования стволовых клеток партеногенетических эмбрионов (parthenogenetic embryonic stem cells - pESC) в терапевтических целях может решить этические проблемы, связанные с получением эмбриональных стволовых клеток (ESC - ЭСК) и обусловленные созданием и разрушением эмбриона для их получения. ЭСК, полученные из партеногенетических эмбрионов, могли бы иметь большое терапевтическое значение, если бы была показана их способность к дифференцировке, так же, как и ЭСК, полученных обычным путём. Однако, применение pESC в медицине пока невозможно, так как у этих клеток нарушены развитие и способность к дифференцировке. Химерные мыши, полученные при смешении бластомеров нормальных и партеногенетических эмбрионов, задерживались в росте, у них наблюдалось частое образование опухолей [4].

Исследователям из Японии во главе с Takafusa Hikichi удалось повысить жизнеспособность и способность к дифференцировке pESC мыши с помощью технологии переноса ядра (nuclear transfer - NT). Ядро из pESC было перенесено в энуклеированный ооцит, затем из него были получены новые клетки - NT-pESC. Таким образом было получено 84 клеточных линии. Некоторые линии были получены вследствие неоднократного переноса ядра. Все эти линии несли маркеры ЭСК и имели нормальный кариотип. Способность к дифференцировке этих клеток была значительно выше, чем у обычных pESC, что показано серией экспериментов in vitro и in vivo - в химерных мышах.

Исследователи использовали две различные линии мышей для получения pESC, чтобы избежать нарушений развития, связанных с вырождением. Одна из этих линий -трансгенная - содержала маркёрный белок GFP. Хромосомный материал одного ооцита был перенесен в другой, затем искусственно было запущено развитие. Таким образом были получены партеногенетические эмбрионы, а затем и линии pESC (рис.). Далее их ядра были перенесены в ооциты мыши другой линии и индуцировано развитие. Полученные таким образом ESC имели нормальный кариотип и экспрессировали маркёры плюрипотентности - Oct4, Nanog и другие.

Схема эксперимента Hikichi T., Wakayama T. (c изменениями)

Ученые показали возможность дифференцировки этих клеток in vitro в нервную ткань и мезенхиму. В качестве контроля использовали две линии ESC, полученные при обычном оплодотворении. Затем, NT-pESC были использованы для получения химерных мышей. Органы этих мышей проанализировали на содержание клеток NT-pESC и их дериватов (по маркерному белку). В каждом образце устанавливали уровень метилирования импринтированных доменов, которые оказались гипометилированными по сравнению с нормой. При этом клетки NT-pESC химеризовали органы и дифференцировались в тканях мышей.

Таким образом, японская группа исследователей показала положительное влияние процедуры переноса ядра на потенциал развития партеногенетических ЗСК. Интересно, что в полученных линиях NT-pESC не наблюдали феномена потери X-хромосомы, что обычно бывает при партеногенезе. В данном эксперименте все кариотипические и эпигенетические характеристики линий сохранялись, как и у pESC, на протяжении нескольких пассажей (до 30). Кроме того, уровень успешного образования клеточных линий после переноса ядра партогенетической клетки в ооцит был в полтора-два раза выше, чем при получении NT-ESC, когда донором ядра были соматические клетки или нормальные ESC. Причины этого неясны. Можно предположить, что улучшенное развитие, дифференцировка и жизнеспособность этих клеток явились следствием отбора самых лучших клеток для донорства ядра и цитоплазмы, и этот отбор производился неоднократно в течение двух и более переносов генетического материала в ооцит. Возможно также, что здесь наблюдается влияние новой цитоплазмы ооцита на ядро. В любом случае, положительный эффект переноса ядра на жизнеспособность и потенциал развития клеток NT-pESC был подтвержден серией экспериментов. Причины изменений потенциала развития еще предстоит выяснить. Использование партеногенетических клеток в медицине имеет многообещающие перспективы. Несмотря на генетические нарушения и аномальность развития этих клеток по сравнению с ESC, исследования в этой области имеют также и большое фундаментальное значение.

About the authors

T. Lopatina

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1

Download (93KB)

Indexing metadata