Interspecies nuclear transfer: an insurmountable natural barrier or a temporary technical obstacle?

Full Text

Клонирование методом переноса ядра (somatiс сell пuсlear traпsfer, SCNТ) с целью получения эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека сталкивается с серьезными морально-этическими проблемами, связанными с использованием женских овоцитов [1]. Так, если исследования ЭСК приведут к их рутинному использованию в клинической практике, то овоциты могут стать своего рода товаром, а женщины попадут под особое давление. Кроме того, отдаленные последствия самой процедуры получения овоцитов у женщин-доноров (к примеру, связанные с многократной гормональной стимуляцией) пока не ясны. К настоящему моменту предложено несколько альтернатив, позволяющих не привлекать овоциты для получения ЭСК. Во-первых, - это отказ от использования овоцитов вообще и переход от технологии переноса ядра к направленному перепрограммированию генома за счет активации экспрессии определенных генов (получение iРS-клеток). Во-вторых, - индукция дифференцировки овоцитов из стволовых клеток другого происхождения. В-третьих, попытки применения овоцитов от других видов животных (т. н. межвидовой SCNТ, iSCNТ).

В своем классическом варианте метод SCNТ заключается в пересадке ядра (кариопласта) соматической клетки в предварительно энуклеированную яйцеклетку (цитопласт), находящуюся в профазе II деления мейоза. Благодаря данной технологии к настоящему моменту удалось клонировать многие виды животных, а также получить бластоцисты человека [2]. В случае iSCNТ источником кариопласта и цитопласта являются клетки, происходящие от различных видов животных, но в этом случае эффективность метода значительно снижается, и успешное репродуктивное клонирование остается возможным лишь при использовании близкородственных видов [3]. Эмбрионы, полученные с помощью процедуры iSCNТ, способны развиваться до стадии бластоцисты и в некоторых случаях давать начало культуре ЭСК.

Причина низкой жизнеспособности и нарушений развития таких межвидовых гибридов лежит в несовместимости цитоплазматических факторов (мРНК и белков) овоцита и вводимого генетического материала, который содержится в ядре соматической клетки. Хотя генная транскрипция в клетках сформированного зародыша может наблюдаться уже на самых ранних стадиях деления [4], за эмбриональное развитие длительное время (вплоть до 16-клеточной стадии у коровьего эмбриона) в основном отвечают продукты, заранее накопленные в овоците. Полагают, что явление «перепрограммирования» ядра, наблюдаемое при SCNТ, зависит именно от этих овоцитарных факторов.

Кроме того, несовместимость цитоплазмы и ядра в межвидовых гибридных эмбрионах, приводящая в итоге к их гибели, во многом связана с присутствием в цитоплазме эмбриональных клеток чужеродного митохондриального генома. Как и в случае переноса ядра, трансфер митохондрий из клеток животного одного вида в лишенные митохондрий клетки животного другого вида может быть успешен лишь у близкородственных видов. Например, в клеточных линиях человека, не содержащих митохондрий, «приживаются» и функционируют митохондрии из клеток шимпанзе и гориллы, чего, однако, не происходит с митохондриями орангутана [3]. Более того, в период имплантации экспрессия минорных антигенов гистосовместимости, кодируемых «чужеродной» митохондриальной ДНК, потенциально может приводить к иммуноопосредованному отторжению гибридного эмбриона.

Полагают, что в межвидовых гибридных эмбрионах происходит дисрегуляция генной экспрессии вследствие несовместимости цитопласта и кариопласта. Известно, к примеру, что активация ядра (активация генной транскрипции в клетках эмбриона после оплодотворения) у разных видов происходит в различные моменты развития [4], что может отражаться на процессах перепрограммирования ядра в межвидовых гибридах. Тем не менее, до настоящего времени характер транскрипции генов, задействованных в контроле эмбриогенеза в межвидовых SCNТ-гибридах не анализировался. Особый интерес в этом случае представляет исследование экспрессии генов, контролирующих недифференцированный статус эмбриональных клеток, вовлеченных в адгезионные взаимодействия во время образования морулы и бластоцисты, а также отвечающих за первичную клеточную специализацию в бластоцисте.

Какое влияние оказывают чужеродные цитоплазматические факторы на активацию и динамику генной экспрессии в межвидовых гибридных эмбрионах? На этот вопрос попытались ответить китайские исследователи под руководством H.Z. Sheng и D.Y. Chen, которые для анализа выбрали три центральных регулятора плюрипотентности - транскрипционные факторы Oсt4, Soх2 и Nanog, а также Е-кадгерин - адгезивную молекулу, необходимую для формирования бластоцисты (установления адгезионных контактов в трофобласте). При этом источником цитопласта служил овоцит коровы, а генетический материал принадлежал фибробласту человека. Подходящие для эксперимента незрелые овоциты отбирались по морфологическим критериям (гомогенность цитоплазмы, наличие нескольких слоев фолликулярных клеток), после чего клетки культивировались до достижения зрелого состояния. В эксперименте использовали овоциты, находящиеся в метафазе II деления мейоза. После обработки цитохалазином В проводилась аспирация митотических хромосом и первого полярного тельца с помощью микропипетки. Затем в перивителлиновое пространство энуклеированного овоцита помещали человеческий фибробласт. Слияние цитоплазматических мембран полученного гибридного комплекса проводилось с помощью электрофузионной системы. Через 3 часа гибридные эмбрионы подвергались химической активации иономицином и культивировались на монослое мышиных эмбриональных фибробластов.

Успешность процедуры iSCNТ подтверждалась на стадии 16-клеточного эмбриона методом качественной ПЦР с использованием праймеров к специфическим последовательностям генома человека и коровы (соответственно альфоидная и Alu-подобная последовательности). Анализ экспрессии мРНК транскрипционных факторов человека Oсt4, Soх2 и Nanog, а также Е-кадгерина проводили методом обратнотранскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР). В качестве «референсной» экспрессии анализировалась экспрессия гена β-актина человека, а положительным контролем ОТ-ПЦР служила экспрессия гомологичного фрагмента β-актина, общего для человека и коровы. Последовательность амплифицированных ПЦР-продуктов была затем подтверждена путем секвенирования.

Всего было осуществлено 28 опытов по переносу ядра, в результате которых исследователи получили 3315 гибридных эмбрионов. з них 8-клеточной стадии достигли 21,4% гибридов, 16-клеточной - 9%, стадии бластоцисты - 0,87% (29 гибридов). Сама технология получения таких цитоплазматических гибридов оказалась высоко эффективной: абсолютное большинство проанализированных 16-клеточных гибридных зародышей содержало геном человека, о чем свидетельствовало присутствие характерных альфоидных повторов.

Экспрессия генов человека Oсt4, Soх2, Nanog и Е-кадгерина анализировалась сразу после слияния клеток, на 2-, 4-, 8-, 16-клеточной стадиях, стадии морулы и бластоцисты. нтересно, что уже на одноклеточной стадии у некоторых гибридов был отмечен низкий уровень экспрессии Oсt4 (2 из 24) и Soх2 (3 из 47). По словам авторов, экспрессия факторов транскрипции Oсt4 и Soх2 может также наблюдаться в фибробластах еще перед слиянием. Действительно, в литературе имеют место сообщения о том, что в некоторых дифференцированных клетках может отмечаться слабая, но устойчивая экспрессия этих генов плюрипотентности [5]. Тем не менее, значимость подобной экспрессии не ясна, и, более того, это может быть результатом амплификации присутствующих в геноме псевдогенов, что, в частности, было недавно показано для Oсt4 [6].

Активация генной транскрипции в гибридных эмбрионах происходила при переходе от 8-клеточной к 16-клеточной стадии развития: на обеих стадиях отмечалась выраженная экспрессия всех четырех исследуемых генов. Это позволило авторам сделать вывод о том, что время активации эмбрионального генома определяется факторами, происходящими от клетки-донора цитопласта, т. е. коровьего овоцита. эмбриона человека запуск генной транскрипции происходит несколько раньше, чем у крупного рогатого скота - при переходе от 4- к 8-клеточной стадии [7].

Тем не менее, генная экспрессия в полученных гибридных эмбрионах была неоднородной и, по-видимому, носила случайный характер. В то время как в одних гибридных клетках отмечалась выраженная экспрессия всех четырех генов, в других обнаруживались лишь некоторые транскрипты либо экспрессия вовсе не была выявлена. Следует заметить, что нарушение экспрессии Oсt4 и других функционально схожих генов обнаружено и в клетках эмбрионов, клонированных «классическим» методом, без использования межвидового переноса ядра [8]. Далее авторы отмечают, что более выраженный потенциал эмбриона к дальнейшему развитию отражается в более активной экспрессии генов Oсt4, Soх2, Nanog и Е-кадгерина (все гибриды, достигшие стадии бластоцисты, экспрессировали указанные гены). Если же генетический материал гибридной клетки недостаточно активирован, то эмбриогенез останавливался.

Авторы данной работы не ставили своей целью получить линию ЭСК из эмбриобласта гибридных бластоцист. В 2003 г. эта исследовательская группа уже опубликовывала результаты схожего эксперимента, где в качестве донора цитоплазмы вместо коровьего овоцита выступал овоцит кролика [9]. Происхождение полученных таким образом ЭСК человека было подтверждено с помощью цитогенетических методов, ПЦР-анализа и иммуноцитохимии. Однако гибридные ЭСК, дифференцировавшиеся в клетки трех зародышевых листков in vitro, не вызывали развития тератом после введения иммунодефицитным мышам, что, как известно, имеет основное значение для доказательства их плюрипотентного статуса [3].

В статье также не уточняется, каким образом анализировался профиль экспрессируемых генов на более поздних предимплантационных стадиях (морула, бластоциста), на которых начинаются процессы клеточной специализации. Очевидно, что экспрессия транскрипционных регуляторов плюрипотентности будет отличаться в клетках трофобласта и внутренней клеточной массы. Например, известно, что экспрессия Oсt4 значительно снижена в клетках трофобласта человека [10].

Пока не ясно, какое влияние может оказывать присутствие митохондриальной ДНК овоцита на характер и время экспрессии плюрипотентных генов в гибридных эмбрионах. Интересно также отметить, что в этой работе для интеграции ядра фибробласта в цитоплазму овоцита использовали слияние, что предполагает попадание митохондрий фибробласта в гибридный эмбрион. Вопрос о том, каким образом происходит совмещение двух митохондриальных геномов в одной клетке, и как это влияет на развитие зародыша и генную экспрессию в ходе эмбриогенеза, пока остается открытым.

Одна из задач будущих исследований - анализ дифференциального вклада различных факторов гибридной несовместимости в глобальные перестройки генной экспрессии в межвидовых гибридах. Вероятно, что за нарушенное перепрограммирование генома и дефектное развитие гибридного зародыша ответственные лишь некоторые факторы овоцитарной цитоплазмы. В результате, генетическая модификация овоцитов перед процедурой iSCNТ сможет снизить последствия гибридной несовместимости и сделать получение пациент-специфических ЭСК человека с помощью описанной технологии реальной возможностью.

About the authors

A. A. Lelyavsky

Author for correspondence.
Email: bozo.ilya@gmail.com

References

Supplementary files