The morphology and chemistry of a rat spinal cord after thoracal segmentectomy and transplantation of polymeric collagen neuromatrix “Spherogel - E”™ containing incorporated ensheathing neuroepithelial cells

Full Text

Введение

Активное изучение репаративного потенциала стволовых клеток в настоящее время служит основанием для существенной корректировки некоторых аксиом классической неврологии, касающихся ограниченных возможностей нейрона к самовосстановлению. В этой связи в клинико-экспериментальной практике наблюдается отчетливая тенденция к отходу от традиционно пессимистической оценки реабилитационных возможностей больных с травмой спинного мозга [1, 2]. Известно, что основным препятствием на пути к клинически ценному восстановлению у спинальных больных является посттравматический глиальный рубец и обширные «пустые» пространства, которые необходимо преодолеть растущим аксонам для установления утраченных связей [3]. С другой стороны, при отсутствии консолидирующей ткани рубца между краниальным и каудальным отрезками спинного мозга [в случае обширных повреждений], они подвергаются ретракции, что делает восстановление нервных связей невозможным [4, 5]. Поэтому важной задачей реконструктивной нейромедицины является выявление способов управления скоростью и качеством образующейся ткани, замещающей нейрональный дефект.

Значительным шагом в этом направлении стало использование биополимерных материалов, в большой степени решающих эту задачу, а также создающих оптимальные условия для выживания трансплантированных клеточных культур и реализации их репаративных возможностей. В ряде экспериментов на животных было показано, что через имплантируемую биополимерную композицию, создающую своеобразный «мост» между концами рассеченного спинного мозга, возможно прорастание поврежденных аксонов и восстановление некоторых утраченных функций спинного мозга [6, 7]. При этом, мультипотентные клеточные элементы, внесенные в гелевую полимерную среду, продолжают активно функционировать, направляя вектор своей дифференцировки в соответствии с условиями локального микроокружения [8]. Это, в конечном итоге, способствует созданию благоприятных возможностей для регенерации нервных волокон, что во многом обусловлено секреторной нейротрофической деятельностью клеточных трансплантатов [8, 9].

В настоящее время вопрос о выборе оптимального клеточного материала для биоинженерной терапии таких повреждений встает особенно остро. Нерешенность ряда как биомедицинских [иммунологический конфликт, онкологическая опасность), так и этико-правовых вопросов существенно ограничивает спектр допустимых для применения клеточных линий. В свете вышесказанного, использование обкладочных нейроэпителиальных клеток [ОНК] позволяет избежать проблем иммунного конфликта, а технология их получения не имеет этических, юридических и моральных ограничений. Использование только собственного донорского материала снижает [исключает] риск заражения пациента. ОНК могут быть в достаточном количестве получены из образцов ткани обонятельной выстилки носа, не формируя при этом непоправимого тканевого дефекта, поскольку их популяция находится в состоянии непрерывного самообновления [10].

В качестве основы для тканевой терапии современные исследователи предлагают использовать различные природные и синтетические материалы - коллаген, полиглюколе- вую кислоту, карбониловые нити и т. д. [11, 12]. Наилучшие результаты в этом направлении были получены влаборато- рии S. Woerly [1993-1998], который предложил заполнять дефекты нервной ткани биополимерным протезом «НейроГель»™ [7], и Ch. Vacanty с соавт. [1996], которые описали результаты экспериментального использования биоматрикса [6]. В России сотрудники клиники «НейроВита» [А.С. Брюховецкий с соавт., 2002] совместно с лабораторией биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов М3 РФ [В.И. Севастьянов с соавт., 2002, 2004] разработали и запатентовали универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс «Сферогель-Э»™ и отработали способ его получения и использования [патент РФ RU №2249462]. Помимо функции «моста» Сферогель-Э™ способен выполнять роль «питательной среды» для содержащихся в нем клеточных элементов, индуцирующих прорастание поврежденных аксонов нервных клеток через патологически измененные участки ткани спинного мозга [11].

Целью настоящего исследования была оценка тканевых перестроек, пролиферативных процессов и характера нейрохимических изменений в тканях рубца спинного мозга у крыс, перенесших торакальную сегментэктомию с последующей трансплантацией ОНК, инкорпорированных в биополимерный нейроматрикс «СферогГель-Э»™.

Материал и методы

В эксперименте использованы половозрелые беспородные крысы самки массой не менее 300 г. Все животные были разделены на две группы - контрольную [n=12] и опытную [n=10]. Нами использована экспериментальная модель травмы спинного мозга, разработанная S. Woerly [2001] [7] и создающая ситуацию полного анатомического перерыва с утратой целостности спинномозговых оболочек. Обезболивание осуществлялось путем внутрибрюшинного введения 1 мл смеси, состоящей из 2% раствора ксилазина [0,18 мл], 10% раствора кетамина [0,36 мл] и 0,5% раствора новокаина [0,46 мл]. После проведения торакальной сегментэктомии [иссечение фрагмента спинного мозга на уровне Th8-Th10] у крыс контрольной группы дефект спинного мозга заполняли гемостатической губкой и изолировали от окружающих тканей подкожно-жировой клетчаткой. У крыс опытной группы дефект спинного мозга заполняли препаратом «Сферогель-Э»™с инкорпорированными в него ОНК. ОНК внедряли в нейроматрикс непосредственно перед трансплантацией путем последовательного наслаивания и центрифугирования [1000 об/мин, 10 мин.] при температуре +10°С и вводили в количестве 250 тыс. каждому животному. Биополимерный нейроматрикс «Сферогель-Э»™ и культура обкладочных нейроэпителиальных клеток слизистой оболочки носа человека, полученная по методике X. Zhang и совт. [2004] [13], были доставлены из лаборатории ЗАО «НейроВита» [Россия, Москва].

Условия содержания животных, проведения операции и послеоперационного ухода соответствовали требованиям правил лабораторной практики в РФ [2003 г.].

Для проведения гистологического анализа изменений тканей спинного мозга в ранний [через 1-2 недели] и поздний [10-12 недель] послеоперационный период животных усыпляли путем внутрибрюшинного введения 10% раствора кетамина. Участок позвоночного столба длиной 2-2,5 см, содержащий фрагмент поврежденного спинного мозга, фиксировли в 10% нейтральном забуференном формалине. После декальцинации в растворе муравьиной кислоты образцы заключали в парафин. Гистологические препараты изготавливали по традиционной методике. Продольные срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и 1% раствором метиленового синего.

Для иммуногистохимического анализа использовались моноклональные антитела к GAP-43 [Chemicon, AntiGrowth Associated Protein 43, clone 9-1E12, P17677,1:10] и NF-200 [Chemicon, Anti-Neurofilament H&M, phosphorylated, clone NP1, P12036, 1:50]. После депарафинирования и регидратации срезов их прогревали на водяной бане в предварительно нагретом до 95-99°С 10 мМ цитратном буфере [pH 6.0] в течение 30 минут для «демаскировки» антигенов. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15-20 мин. и переносили в 0.1 М фосфатный буфер [pH 7.4] на 5 мин. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 15 мин. в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина и 1% растворе нормальной лошадиной сыворотки, приготовленном на 0.1 М фосфатном буфере [pH 7.4]. Инкубацию с первичными антителами проводили при 37°С в течение 1 часа, затем промывали 2 раза по 10 минут в фосфатном буфере. Иммунологическое выявление мест связывания антител проводили с помощью непрямой стрептавиадин-биотин-пероксидазной реакции с использованием стандартного набора VECTASTAIN Elite ABC Kit Universal [Vector laboratories, PK-7200] в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

Результаты

В зависимости от сроков послеоперационного периода все животные были разделены на две группы: 1-2 неделя [ранний период] и 10-12 неделя [поздний период]. При гистологическом исследовании тканей спинного мозга животных контрольной и экспериментальных групп обнаружены значительные различия в темпах и характере морфологических изменений, сопровождающих организацию послеоперационного дефекта. Основное внимание мы сконцентрировали на состоянии тканей спинного мозга в области перерезки и пограничных участках.

Через одну неделю после операции у животных контрольной группы консолидация пересеченных фрагментов спинного мозга была еще не завершена: полость между краниальной и каудальной культями заполнена рыхлыми фибриновыми массами, которые перемежаются с очагами кровоизлияний и локальными воспалительными инфильтратами [рис. 1А-Д). В латеральных отделах рубца, примыкающих к мозговым оболочкам, отложения фибрина отграничены соединительно-тканными пластами, которые создавали на границе с веществом СМ рыхлую капсулу, в которой содержатся расширенные микрососуды и клетки воспалительных инфильтратов.

 

Рис 1. Структура рубцовой ткани в области перерезки спинного мозга у животных контрольной (А, Б, В, Д) и экспериментальной (Г, Е) групп через 1-2 недели после операции. В ткани рубца (р) контрольных животных (А) выявляются отложения нитей фибрина (ф), большое количество лимфоидных инфильтратов (л), а пролиферирующие астроциты (а) скапливаются на границе с веществом мозга (м). В большинстве нервных и глиальных клеток, расположенных в прилежащих областях мозга (Б), определяются признаки глубоких дистрофических изменений в виде вакуолизации цитоплазмы. В области формирования капсулы у контрольных животных глиальные клетки многослойный ограничительный вал, в котором присутствуют единичные фибробласты (В, указаны стрелками), в то время как у животных экспериментальной группы астроциты в пограничной капсуле выстраиваются в длинные продольные тяжи (Г), а многочисленные фибробласты ограничивают стенку новообразованных сосудов (Б), указаны короткими стрелками). Воспалительная реакция в тканях спинного мозга контрольных животных обеспечивается, в основном, полиморфоноядеными гранулоцитами (Д), а у экспериментальных животных в эти сроки наиболее выражена макрофагальнгая активность (Б, указаны длинными стрелками). Окраска: гематоксилином и эозином (А) и метиленовым синим (Б-E). Масштаб: А - 350 мкм, Б-Е - 50 мкм

 

В центре рубца нити фибрина формируют подобие клубка, в то время как на границе с нервной тканью начинается образование глиальной капсулы, толщина и структура которой имеет неоднородное строение. Наиболее типичным для этого периода являются локальные скопления астроцитов на границе рубца, расположенных, преимущественно перпендикулярно длинной оси спинного мозга (см. рис. 1B). В результате между тканью еще не оформленного рубца и смежными зонами образуется отчетливый ограничительный валик, по обе стороны которого наблюдаются единичные или сгруппированные в небольшие кластеры макрофаги и нейтрофилы. В центральных зонах тканевого дефекта, в участках локальных гематом они превращаются в гемосидерофаги с цитоплазмой, наполненной продуктами распада эритроцитов.

В разреженном веществе спинного мозга, прилегающего к области травмы, как в краниальном, так и в каудальном направлениях, рисунок спинного мозга с резко очерченными границами серого и белого вещества практически не выявляется. Здесь обнаруживаются многочисленные пустоты, различной формы и величины. Скопления отечной жидкости вокруг капилляров, нейронов и глиальных клеток придают ткани мозга сотовидный, ячеистый вид. При малом увеличении микроскопа можно заметить, что заполненные тканевой жидкостью пространства, приобретая сливной характер, разрывают нервную ткань на многочисленные обособленные фрагменты.

Гемодинамические нарушения, максимально выраженные в пограничных зонах, реализуются как путем облитерации и запустения мелких артериол, так и за счет избыточного их расширения и гиперемии. Клетки интимы набухают и выступают в просвет сосуда, а перикапиллярные пространства расширены за счет выхода жидкой части крови через истонченные стенки сосуда. Вследствие некробиотических изменений сосудистой оболочки форменные элементы крови выходят за пределы сосуда, скапливаясь у наружной его границы или постепенно мигрируют вглубь мозговой паренхимы, приводя к образованию вторичных, диапедезных кровоизлияний.

В спинном мозге животных опытной группы в этот период обращают на себя внимание характерные изменения в области рубца. Его структура сформирована, большей частью, элементами соединительной ткани, в которой происходит образование новых капилляров (см. рис. 1Е). Соединительнотканные прослойки, окруженные фрагментами «Сферогеля», перемежаются с участками ткани, заполненными глиальными элементами. Пролиферирующие астроциты здесь выстраиваются в тонкие, длинные цепочки, пронизывающие всю толщу рубца и ориентированные вдоль оси спинного мозга (см. рис. 1Г). Сходный глиопролиферативный процесс протекает и в промежуточной зоне, в результате чего не наблюдается формирование глиомезодермальной капсулы.

В этот период воспалительные процессы наиболее ярко протекают в промежуточной зоне и в прилегающих к ней участках рубца. Они морфологически проявляется инфильтрацией большим количеством макрофагов, сидерофагов, и некоторых лимфоидных клеток (см. рис. 1Е). Морфологические признаки изменений нейронов, глиальных клеток и элементов микроциркуляторного русла сходны с таковыми в контрольной группе и проявляются в виде набухания, вакуолизации цитоплазмы (см. рис. 1Б) или резкого сморщивания.

Через 10-12 нед. у крыс обеих экспериментальных групп соединительнотканный рубец полностью сформирован. В контрольной группе он представлен глиомезодермальной тканью с большим количеством соединительнотканных волокон, ориентированных в различных направлениях. В стенке рубца пучки соединительнотканных волокон и расположенные между ними фибробластов и глиальных клеток (очевидно, пролиферирующих астроцитов) имеют, преимущественно, перпендикулярное длиннику спинного мозга направление. Рубец у животных экспериментальной группы выглядит более рыхло. В его структуре встречаются многочисленные полости, заполненные тканевой жидкостью и окруженные прослойками соединительной ткани, с большим числом капилляров. При окрашивании метиленовым синим в соединительнотканных тяжах наблюдается большое число пучков миелинизированных нервных волокон (рис. 2).

 

Рис. 2. Сформированный соединительнотканный рубец в спинном мозге экспериментальных животных через 10-12 нед. после перерезки. В толще рубца наблюдается большое число нервных волокон, собранных в пучки (Б, указаны стрелками), либо расположенных поодиночке. Окраска: метиленовый синий. Масштаб: А — 250 мкм, Б — 50 мкм.

 

При иммуногистохимическом исследовании на GAP-43 в тканях рубца экспериментальных животных выявляется большое количество иммунопозитивных клеток. Они имеют веретеновидную форму тела, от которого отходят длинные неветвящиеся отростки (рис. ЗА). Максимальное скопление клеточных тел расположено в центральных зонах мозгового рубца (см. рис. З А, Б), в то время как на периферии (в области проекции белого вещества) доминирующими являются GAP-43-позитивные нервные волокна. Они имеют прямолинейный ход, четкие очертания, мало ветвятся и не образуют пучков (см. рис. ЗВ). У животных контрольной группы, в эти сроки выявляются только единичные GAP-43-позитивные клеточные элементы и тонкие волокна, преимущественно расположенные в пограничной зоне рубца краниальнее места повреждения (см. рис. ЗГ).

 

Рис. 3. Иммуногистохимическое окрашивание тканей спинного мозга на GAP43 у экспериментальных (A-В) и контрольных (Г) животных через 10-13 нед. после операции. Распределение меченных клеток в области сформированной рубцовой ткани в центральных отделах мозга (А, Б) и на периферии (В, Г). Масштаб: А — 500 мкм, Б-Г — 30 мкм

 

Антителами на NF-200 у животных экспериментальной группы маркируется, исключительно нервные волокна (рис. 4). В отличие от животных контрольной группы, где наблюдаются только единичные NF-200 проводники, у крыс экспериментальной группы в толще рубца большое количество проводников содержит этот белок.

 

Рис. 4. Иммуногистохимическое выявление NF-300 в нервных волокнах, прорастающих через ткань рубца в спинном мозге контрольных животных (А) и крыс экспериментальной группы «Сферогель+клетки» на продольных (А-В) и на поперечных (Г) срезах. Масштаб 20 мкм

 

Обсуждение

Характер тканевых перестроек в спинном мозге у животных контрольной группы на 1-2 нед. полностью соответствует классическому посттравматическому стереотипу, неоднократно описанному в литературе [14], который ведет к формированию через 10-12 нед. типичного глиально-со­единительнотканного рубца, ограниченного от прилежащих тканей плотной капсулой. У животных, дефект спинного моз­га которых заполнялся нейроматриксом «Сферогель - Э»™ с обкладочными клетками, к концу эксперимента рубец полностью сформирован тканью, имеющий иную цитоархитектонику. Наряду с развитой сетью астроцитов, здесь присутствуют также элементы соединительной ткани - фибробласты, пучки волокон и новообразованные микрососуды. Это свидетельствует о более раннем начале ангиогенеза и, следовательно, лучшей оксигенации рубца. Отличительной особенностью данного способа реконструкции нервной ткани является обилие нервных волокон, сопровождающих прослойки ткани в области сформированного рубца.

Предпосылки к такого рода морфологическому эффекту наблюдались уже на раннем этапе эксперимента. Так, у животных опытной группы через 1-2 нед. после операции, обращает на себя внимание иная архитектоника пролиферирующих астроцитов, которые выстраиваются в виде длинных клеточных тяжей направленных параллельно длиннику спинного мозга как внутри рубца, так и в пограничной зоне. В то же время астроцитарная реакция в контрольных образцах, протекает, преимущественно, в поперечном направлении и, очевидно, служит препятствием для развития соединитель­нотканных элементов и дальнейшего роста нервных волокон.

Таким образом, использование «Сферогеля-Э™» с ин­корпорированной культурой ОHK позволяет сформировать более качественную протезирующую ткань между каудальным и краниальным отрезками спинного мозга, что не только позволяет избежать их ретракции, но и создает более благоприятные условия для регенерации аксонов, препятствуя образования глиальной демаркационной линии. Необходимо отметить, что похожие результаты уже получены рядом исследователей в эксперименте с использованием «Сферогеля-Э™» и культуры эмбриональных нервных клеток, полученных из головного мозга крыс [15]. Использование ОНК в нашем эксперименте продиктовано огромным вниманием к ним как наилучшему клеточному материалу для трансплантации. Существуют данные, что ОНК в определенных условиях способны дифференцироваться в нейроны и глиальные элементы, что делает их весьма привлекательным объектом клеточной терапии неврологической патологии [16, 17]. С этих позиций, обнаружение по результатам иммуногистохимического анализа у животных опытной группы GAP43 - основного белка аксоногенеза и NF-200 - белка промежуточных нейрофиламентов, типичного для тканей нейронального происхождения, с достоверностью подтвер­ждает широко обсуждаемую в литературе гипотезу о секре­ции обкладочными нейроэпителиальными клетками ряда нейротрофических факторов, способствующих ремиелинизации поврежденных нервных волокон, и способности этих клеток при создании соответствующих условий дифференцироваться в нейрональном направлении [15, 16, 18].

Работа выполнена при финансовой поддержке Фонда содействия отечественной науке.

About the authors

I. S. Bryukhovetsky

Vladivostok State Medical University

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Vladivostok

I. V. Dyuizen

Vladivostok State Medical University

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Vladivostok

P. A. Motavkin

A.V Zhirmunsky Institute of Marine Biology, the Far Eastern Branch of the PAS

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files