Effect of Nonspecific Inhibitors of DNA Methyltransferase and Histone Deacetylase on the Efficiency of Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Full Text

Стволовые клетки, специфичные для определенного индивидуума (iPS-клетки) могут быть созданы путем репрограммирования соматических клеток. Не так давно передовые исследования японских и американских ученых показали, что эктопическая экспрессия лишь четырех факторов транскрипции Oct4, Кlf4, Sox2 и c-Мyc репрограммирует мышиные эмбриональные фибробласты (МЭФ) в ЭСК-подобные клетки [1, 2]. Аналогичные эксперименты оказались успешными и с человеческими клетками [3, 4], что позволяет предположить универсальность механизмов репрограммирования клеток. Однако, репрограммирование с применением ретровирусов оказалось медленным и малоэффективным процессом. Кроме того, генетическая трансформация с помощью экзогенных генов, в особенности, онкогенов, таких как c-Мyc и Кlf4 и использование ретровирусной системы доставки значительно осложняют будущее терапевтическое применение этого метода. Поэтому необходима разработка новых протоколов получения индивидуальных линий репрограммированных клеток, достаточно эффективных и потенциально подходящих для использования в клинике.

Предыдущие исследования показали, что ингибитор гистоновой деацетилазы (histone deacetylase, НDAC) и деметилирование ДНК оказывают положительное влияние на эффективность репрограммирования при переносе ядра соматической клетки [5]. Этот факт натолкнул некоторых исследователей на мысль о том, что неспецифические эпигенетические регуляторы могут увеличить эффективность получения iPS-клеток.

Группа под руководством D. Мelton опубликовала работу, результаты которой свидетельствуют о том, что ингибиторы ДНК-метилтрансферазы и гистоновой деацетилазы повышают эффективность репрограммирования в десятки и сотни раз на примере трансгенных Oct4-GFP МЭФ.

Используя трансген Oct4-GFP исследователи проверили как выбранные небольшие молекулы влияют на модификацию хроматина и репрограммирование. Эктопическая экспрессия четырех факторов транскрипции (Oct4, Sox2, Кlf4 и c-Мyc) в трансгенных МЭФ Oct4-GFP индуцировала экспрессию GFP у 0,03±0,02% клеток (на 7 сут. после введения векторов). Процент GFP⁺ клеток оставался одинаковым вплоть до 13 сут. Инкубация трансфецированных МЭФ с 5-азацитидином, ингибитором ДНК-метилтрансферазы, увеличивало количество GFP клеток примерно в 10 раз (до 0,50±0,06%). При этом действие этого агента было дозозависимым.

Дексаметазон, синтетический глюкокортикоид, увеличивал воздействие 5-азацитидина в 2,6 раза (при использовании в сочетании). При этом только дексаметазон не оказывал такого воздействия. Три известных ингибитора НDAC, субероиланилид гидроксамовой кислоты (SAНA), трихостатин A (ТSA) и вальпроевая кислота (VPA) также значительно увеличивали эффективность репрограммирования. При этом действие VPA было наибольшим. Так воздействие на МЭФ VPA в течение 1 нед. позволило добиться получения 11,8±2,2% GFP клеток, что в 4100 раз превышает контрольные показатели. Вещество также проявляет дозозависимый эффект. Возможно, что такая значительная разница в эффективности исследованных препаратов объясняется тем, что все они (кроме VPA) являются токсичными уже в небольших концентрациях.

Ранее было показано, что репрограммирование возможно и при применении всего трех факторов (Oct4, Sox2 и Кlf4) без c-Мyc [6]. Однако, эффективность такого репрограммирования крайне низка, а колонии iPS клеток появляются поздно. Лишь одна колония iPS клеток формируется из ста тысяч трансфецированных фибробластов кожи человека (эффективность 0,001%) [6]. Поэтому исследователи также проанализировали способность клеток, подвергнутых воздействию 5-азацитидина и VPA, к формированию колоний iPS клеток при трансфекции тремя факторами.

Oct4-GFP МЭФ были инфицированы Oct4, Sox2 и Кlf4, а затем подвергнуты воздействию 5-азацитидина и VPA в течение одной недели. Через 10 сут. FACS-анализ зафиксировал увеличение количества GFP⁺ клеток в 3 раза по сравнению с третьими сут. после трансфекции. Воздействие VPA увеличивало эффективность репрограммирования в 50 раз. Это позволило отобрать колонии iPS клеток уже через 2 нед. после трансфекции. Полученные клетки имели типичную для ЭСК морфологию, позитивно окрашивались на щелочную фосфатазу и экспрессировали маркеры плюрипотентности. Исследование паттерна генной экспрессии таких клеток показало, что полученные iPS- клетки значительно отличаются от МЭФ и больше всего напоминают мышиные ЭСК.

Воздействие VPA на нетрансфецированные фибробласты не вызывает увеличения GFP⁺ клеток, следовательно одно лишь воздействие VPA не способно вызвать репрограммирование или другие генетические изменения. Более детальный анализ генной экспрессии показал, что действие VPA вызывает активацию ЭСК-специфических генов и ингибирование экспрессии генов МЭФ.

Таким образом, в исследовании было показано, что неспецифические химические агенты, вызывающие эпигенетические изменения, положительно влияют на эффективность репрограммирования и могут заменить один или более факторов транскрипции.

About the authors

V. S. Melikhova

Author for correspondence.
Email: bozo.ilya@gmail.com

References

Supplementary files