The effect of TiO2 nanotubes layered on surfaces of titanium to be used in implantology on the proliferative and secretory activity of fibroblasts

Full Text

Введение Одной из основных проблем современной имплантологии является успешность остеоинтеграции имплантата, что, в свою очередь, зависит от характера его взаимодействия с окружающими тканями. Функциональная активность клеток в области контакта с имплантатом (адгезия, пролиферация, секреция) во многом определяется структурой его поверхности. Считается установленным, что придание поверхности титанового имплантата шероховатости способствует его интеграции в костную ткань [1, 2]. Модификация поверхности титана может осуществляться различными методами физической или химической обработки, одним из которых является анодирование, т. е. анодное окисление металла с отложением оксидной пленки, повышающей гидрофильность поверхности. При определенных условиях проведения реакции отложение диоксида титана происходит упорядоченно в виде вертикальных нанотрубок, увеличивающих площадь поверхности для адгезии клеток [3]. Оригинальная методика электрохимического анодирования, разработанная нами ранее, позволяет покрывать поверхность имплантата нанотрубками из диоксида титана одинакового диаметра [4]. Имплантация титановых изделий с гладкой поверхностью, зачастую, сопровождается формированием между поверхностью металла и костью фиброзной капсулы, Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 55 состоящей из компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), что приводит к подвижности имплантата, и, как следствие, к развитию в области контакта хронического воспаления с последующей резорбцией кости и отторжением имплантата [5]. Фиброзная капсула состоит преимущественно из коллагенов I и III типов, секретируемых фибробластами [6-8]. Формирование нанотрубчатой поверхности направлено на повышение совместимости имплантата с костной тканью. Одновременно с этим возникает вопрос 0 влиянии модифицированной поверхности имплантата на функциональную активность фибробластов, гиперактивность которых может привести к его отторжению. Цель работы: оценка пролиферативной и секреторной активности фибробластов человека на титане с анодированной нанотрубчатой поверхностью, а также уровня отложения на ней коллагена и неколлагеновых белков. Материал и методы Дизайн эксперимента Сравнительную оценку секреторной и пролиферативной активности фибробластов проводили на поверхности дисков из анодированного титана (n=24), необработанного титана (n=24) и культурального пластика (лунки культуральных планшетов, n=24, контроль). Эксперименты выполняли с двумя линиями фибробластов (линии 1 и 2). Стерильные титановые диски размещали в лунках 24-луночных планшетах (Eppendorf, Германия). Для контроля пролиферации клеток на пластике использовали 24-луночные планшеты с обработанной поверхностью для клеточных культур (Eppendorf, Германия). В лунки планшетов вносили по 640 мкл культуральной среды DMEM-F-12 (Gibco, Великобритания) с фибробластами, содержащей 12% фетальной телячьей сыворотки (Gibco), плотность посева клеток составляла 3х103 кл/ см2. Поскольку клетки адгезировались не только на дисках, но и на пластике, для чистоты экспериментов через 1 сут. после посева диски с прикрепившимися клетками переносили в новые планшеты и заливали свежей ростовой средой в том же объеме. В контрольных планшетах (культуральный пластик) заменяли ростовую среду. При культивировании клеток линии 1 ростовую среду меняли каждые 3 сут., при культивировании клеток линии 2 смена среды не проводилась. Результаты анализировали на 3, 5, 7 и 9 сут. из расчета 6 образцов для каждого типа поверхности в каждой временной точке. На каждом сроке анализа результатов для линии 1 ростовую среду заменяли на аналогичную, но без добавления сыворотки, клетки культивировали в бессывороточной среде течение 24 ч., после чего среду замораживали для оценки количества секретируемых компонентов методом иммуноферментного анализа (ИФА), а клетки на дисках фиксировали для подсчета их количества. Для линии 2 клетки фиксировали в день учета результатов, а ростовую среду, в которой культивировали фибробласты, сразу замораживали для дальнейшего анализа. Таким образом, при оценке секреторной активности клеток линии 1 определяли количество секретированных проколлагена и цитокинов за 1 сут., для линии 2 - их общее количество за все время культивирования до момента фиксации клеток. Клеточные линии В работе использовали 2 линии дермальных фибробластов, выделенных из фрагментов кожи от 2 разных доноров (линия 1 и 2) по методике, описанной ранее [9]. Перед забором фрагментов кожи доноры подписывали информированное согласие. Клетки выращивали в культуральных флаконах Т25 (Nunc, Дания) в ростовой среде, состоящей из смеси питательных сред DMEM и F-12 в соотношении 1:1 (Gibco, Великобритания), 12% фетальной телячьей сыворотки (Gibco, Великобритания), 0,03% глутамина и 50 мкг/ мл гентамицина, в СО2-инкубаторе (37°С, 5% СО2, относительная влажность 100%) до формирования субконфлюентного монослоя плотностью 70-90%. При пересевах для снятия клеток с культурального пластика применяли 0,25% раствор трипсина с ЭДТА (Gibco, Великобритания). Полученные клеточные линии были заморожены на 3 пассаже, хранились в жидком азоте, после разморозки проходили 2 пассажа и далее использовались в эксперименте, т. е. на 5 пассаже. Материалы из титана Эксперименты выполняли на дисках из титановой фольги ВТ1-0 диаметром 13 мм и толщиной 0,21 мм без обработки поверхности (необработанный титан) или с анодированной поверхностью (анодированный титан) (рис. 1). Анодное окисление титана, сопровождающееся образованием на его поверхности нанотрубок диаметром около 40 нм, проводили по оригинальной методике, описанной ранее [4]. Фиксация клеток и оценка их количества на поверхностях Клетки на титановых дисках и на культуральном пластике фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида в течение 18 ч. при 4°С, после чего осуществляли их дегидратацию, последовательно инкубируя в 30, 50, 70 и 95% растворах этанола в течение 10 мин. для каждой концентрации. Количество клеток на поверхностях оценивали по количеству ядер, окрашенных DAPI в концентрации 300 нМ, на флуоресцентном микроскопе (Axio Lab A1 FL, Carl Zeiss, Германия) в канале DAPI при увеличении х100. Поверхность дисков фотографировали в 9 точках (1 точка в центре диска, 4 - на расстоянии 1/2 радиуса и 4 - на расстоянии 2/3 радиуса от центра). Для подсчета количества ядер снимки анализировали в программе ImageJ. Оценка количества коллагена и неколлагеновых белков на поверхностях Подсчет количества коллагена и неколлагеновых белков осуществляли с помощью набора Sirius Red/Fast Green Collagen Staining (#9046, Chondrex, США) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Иммуноферментный анализ Перед проведением иммуноферментного анализа ростовую среду центрифугировали для удаления клеточного детрита. Для оценки концентрации проколлагена I в ростовой среде использовали набор Human ProCollagen I alpha 1 DuoSet ELISA (R&D Systems, США, кат. номер 6220-05), интерлейкина-6 (IL-6) - Интерлейкин-6-ИФА-БЕСТ (Вектор-Бест, Россия, кат. номер А-8768) и интерлейкина 8 (CXCL8) - Интерлейкин-8-ИФА-БЕСТ (Вектор-Бест, Россия, кат. номер А-8762) в соответствии с инструкциями производителей. Статистический анализ Для оценки статистической значимости различий при сравнении 2 групп применяли U-критерий Манна-Уитни, при парном сравнении 3 групп - непараметрический критерий Ньюмена-Кейлса; для выявления корреляции между плотностью клеточного монослоя и количеством секретируемых компонентов - коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 56 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ А \\ Б ш лл-ЧЪ c r 7 ' * УТ - 'X.l l Г 1 f 4 f a f ' • у ( к e * (Jk Va ШЯ . щ W- Ж j 7 v_ à A оЛр |%ÿWVv V ■ ' ' ^ w ЛаО Ж . . Г i 1 Г» Avi» Of ГН V Мзд = 5 00 КХ 1 |im WD = 19 mm ЕНТ = 1 00 kV Mag = 50.00 К X 100 nm W0= 1.9 mm EHT = 1.00 kV SenalNo = Аипда-ЭЗ-56 1-1 FIB Imaging = SEM Scan Speed - 8 Serial No. = Auriga-39-56 | | FIB Imaging = SEM Scan Speed = 8 Рис. 1. Поверхность необработанного (А) и анодированного титана с нанотрубчатой поверхностью (Б). Двулучевая [электронноионная] сканирующая микроскопия (Carl Zeiss Auriga CrossBeam, Германия] титан анодированный ] титан не обработанный 0 пластик культу ральныи Линия 1 Линия 2 Рис. 2. Плотность монослоя дермальных фибробластов на необработанном титане, анодированном титане с нанотрубчатой поверхностью и на культуральном пластике (контроль]. *различия статистически значимы при p<0,05 Результаты Пролиферативная активность Результаты оценки пролиферативной активности клеток представлены на рис. 2. Скорость пролиферации клеток линии 1 была самой высокой на культуральном пластике на всех сроках наблюдения. Напротив, количество клеток линии 2 на культуральном пластике во всех временных точках оказалось ниже, чем на титановых дисках, динамика увеличения количества клеток на пластике по отношению к титановым поверхностям имела «догоняющий» характер, и к 9 сут. количество клеток на пластике и на титане практически выравнивалось. В целом, скорость пролиферации клеток линии 1 была существенно выше, чем линии 2, при этом увеличение количества клеток линии 2 на титановых поверхностях в интервале 7-9 сут. было минимальным, что, очевидно, может быть связано как с индивидуальными особенностями культур, так и с истощением не сменявшейся ростовой среды. Плотность монослоя клеток линии 1 на обработанном и необработанном титане была практически одинаковой, лишь в одной временной точке (3 сут.) данный показатель был достоверно (» в 1,3 раза] выше на нанотрубчатой поверхности. В то же время, количество клеток линии 2 на необработанной поверхности в большинстве случаев было выше, чем на анодированной, но лишь в одной временной точке (7 сут.] эти различия были достоверны (» в 1,5 раза]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что скорость пролиферации фибробластов на нанотрубчатой поверхности, в общем, не выше, чем на необработанной. Отложение коллагена и неколлагеновых белков на поверхности Уровень отложения коллагена и неколлагеновых белков на поверхности оценивали по величине связывания красителей Sirius Red (краситель, связывающийся с коллагеном] и Fast Green (краситель, связывающийся с неколлагеновыми белками]. Необходимо отметить, что уровень неспецифического связывания красителя Sirius Red с поверхностью анодированного титана был существенно выше, чем с пластиком или необработанным титаном, тогда как в отношении красителя Fast Green данный показатель был приблизительно одинаков для всех трех типов поверхностей. При подсчете количества белков делали поправку на уровень неспецифической адгезии красителей на соответствующих поверхностях. Для обеих клеточных линий количество адсорбированного на поверхности коллагена и неколлагеновых Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 57 Линия 1 Линия 2 Рис. 3. Количество коллагена, адсорбированного на поверхности необработанного титана, анодированного титана и культурального пластика. *различия статистически значимы при p<0,05 Линия 1 Линия 2 Рис. 4. Количество неколлагеновых белков, адсорбированных на поверхности необработанного титана, анодированного титана и культурального пластика. *различия статистически значимы при p<0,05 белков определяли на 7 и 9 сут., т. к. в более ранние сроки уровень связывания красителей был недостаточным для подсчета. Достоверных различий в количестве коллагена (в пересчете на единицу площади) на поверхности анодированного и необработанного титана выявлено не было (рис. 3). В то же время, на анодированной поверхности происходило более активное отложение неколлагеновых белков: на обработанном титане их количество было в 1,5-3 раза больше, чем на необработанном, и, как правило, эти различия были достоверными (рис. 4). Секреторная активность фибробластов В супернатанте после суточного культивирования клеток линии 1 концентрация цитокинов была ниже порогового уровня обнаружения во всех временных точках. Количество продуцируемых клетками цитокинов (IL-6 и IL-8/CXCL8), достаточное для обнаружения методом ИФА, было выявлено только при анализе супернатанта клеток линии 2 на 7 и 9 сут. Наибольшее количество IL-6 (в пересчете на 1 х 103 клеток) секретиро-вали фибробласты линии 2 на культуральном пластике, тогда как на анодированном и на необработанном титане его количества достоверно не различались. В отношении CXCL8 ситуация выглядела иначе: на нанотрубчатой поверхности уровень секреции фибробластами данного хемокина был в 2-4 раза выше, чем на необработанном титане и на пластике (рис. 5). Концентрация проколлагена I в ростовой среде была достаточно высокой для оценки как суточного (линия 1), так и суммарного (линия 2) уровня секреции данного белка (рис. 6). Уровень секреции проколлагена клетками линии 1 на культуральном пластике был ниже, чем на металлической поверхности, при этом различия в секреторной активности фибробластов на обоих типах поверхности титана не были достоверными. Различия Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 58 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 5. Уровень секреции IL-6 и IL-8/ CXCL8 дермальными фибробластами (линия 2) на поверхности необработанного титана, анодированного титана и культурального пластика. *различия статистически значимы при p<0,05 тцтак jHMiipgritHiitji hi TUTjn HeçGpuîkjrjï MUtjlll ППКТШ чуп ьгурэп ьи Ы |1 Линия 1 Линия 2 Рис. 6. Уровень секреции проколлагена I дермальными фибробластами на поверхности необработанного титана, анодированного титана и культурального пластика. *различия статистически значимы при p<0,05 в количестве проколлагена I, продуцируемого клетками линии 2, являлись достоверными лишь в одной временной точке (7 сут.), при этом разница между обработанным и необработанным титаном составляла лишь 1,4 раза. Таким образом, различия в уровне секреции проколлагена (в пересчете на количество клеток) фибробластами обеих клеточных линий на анодированном и необработанном титане были минимальными. Обсуждение Успешность остеоинтеграции имплантата во многом определяется характером протекания репаративных процессов. Фибробласты, мигрирующие в очаг посттравматического воспаления, участвуют в регенерации поврежденных тканей, секретируя компоненты ВКМ и формируя грануляционную ткань вокруг имплантата. Фибробласты способны дифференцироваться в миофибробласты, обладающие повышенной способностью к секреции коллагена и, соответственно, к формированию фиброзной капсулы вокруг имплантата [10]. Анодирование титанового имплантата с формированием диоксидных нанотрубок значительно повышает уровень адгезии, скорость пролиферации остеобластов на его поверхности [1 1] и способствует его остеоинтеграции [12]. Побочным эффектом модификации поверхности имплантата может являться стимуляция пролиферативной и секреторной активности фибробластов. Данные о влиянии анодирования поверхности титана на характер взаимодействия с ним фибробластов довольно разноречивы. ряд исследований указывает на более активную пролиферацию дермальных фибробластов человека [13] и фибробластов мыши (NIH/3T3) [1 4, 15] на нанотрубчатой поверхности по сравнению с необработанной. По другим данным, различия в уровне адгезии человеческих дермальных фибробластов на обоих типах поверхности не выявляются [16]. Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 59 При этом во всех этих работах отсутствовала сравнительная оценка секреторной активности фибробластов. ранее проведенное нами сравнение адгезии дермальных фибробластов на поверхности необработанного и анодированного титана не показало существенных различий в количестве и площади адгезировавшихся клеток [9]. В данной работе были использованы 2 клеточные линии дермальных фибробластов, полученные из фрагментов кожи от разных доноров, и культивировавшиеся в разных условиях: с регулярной сменой ростовой среды (линия 1) и без смены среды (линия 2). Культивирование клеток обеих линий осуществлялось в течение 9 сут. с анализом результатов в 4 временных точках. Эксперименты с обеими линиями не выявили существенного влияния формирования нанотрубчатой структуры на пролиферацию фибробластов. Секреторную активность фибробластов на различных типах поверхности сравнивали по количеству продуцируемых клетками цитокинов (IL-6 и CXCL8) и предшественника коллагена I (проколлагена I). Уровень секреции проколлагена I на анодированном и необработанном титане в большинстве случаев не имел статистически достоверных различий. При этом следует отметить, что наиболее низкий уровень секреции проколлагена I (в пересчете на 1х103 клеток) фибробластами линии 1 был отмечен на культуральном пластике, что сочеталось с наиболее высокой плотностью клеточного монослоя на данном типе поверхности. Для фибробластов линии 2 ситуация на 3 и 5 сут. была обратной: более низкая плотность клеточного монослоя и более высокий уровень секреции проколлагена I на пластике по сравнению с металлическими поверхностями. Это позволяет предполагать, что уровень секреции проколлагена I определяется не столько типом поверхности, на которой адгезированы фибробласты, сколько плотностью их монослоя. Данное предположение косвенно подтверждается существованием статистически достоверной обратной корреляции между плотностью монослоя фибробластов и количеством секретируемого ими проколлагена I (в пересчете на количество клеток) для всех временных точек линии 1 и для 3 из 4 временных точек линии 2. Данные литературы также подтверждают снижение уровня синтеза коллагена при росте плотности клеточного монослоя [17]. Достоверных различий по уровню секреции IL-6 на анодированном и необработанном титане обнаружено не было. IL-6 участвует в стимуляции хронического воспаления и, кроме того, способствует развитию фиброза [18]. В то же время, уровень секреции IL-8 на анодированном титане был существенно (в 2-4 раза) выше, чем на необработанном титане и на культуральном пластике как в пересчете на 1х103 клеток (рис. 5), так и на объем среды (данные не представлены). Это подтверждает, что высокий уровень секреции IL-8 на анодированном титане связан с типом поверхности и не может объясняться различиями в плотности клеточного монослоя. IL-8 является хемокином, привлекающим нейтрофилы и инициирующим воспалительную реакцию, при этом повышенная экспрессия данного цитокина ассоциирована с отторжением имплантатов [19]. Таким образом, высокий уровень секреции IL-8 на анодированном титане может рассматриваться как негативный побочный эффект формирования нанотрубчатой поверхности имплантата. Также нами было проведено сравнение уровня отложения коллагена и неколлагеновых белков на исследуемых поверхностях. Отсутствие достоверных различий в количестве коллагена на обоих типах титановой поверхности позволяет предполагать, что интенсивность формирования фиброзной капсулы на анодированном имплантате не должна быть выше, чем на необработанном. В то же время, количество неколлагеновых белков на поверхности анодированного титана было существенно больше, чем на неанодированном. Источником неколлагеновых белков могут являться сами фибробласты и, кроме того, возможно отложение белков из содержащейся в среде сыворотки, что имитирует адсорбцию белковых компонентов тканевых жидкостей (в том числе, крови) на поверхности материала при имплантации [20]. Принимая во внимание, что адсорбция фибронектина или альбумина на поверхности титана активизирует адгезию на нем остеобластов [21], можно предположить, что повышенный уровень адсорбции неколлагеновых белков на нанотрубчатой поверхности имплантата будет способствовать его интеграции в костную ткань. Выводы 1. Пролиферативная активность дермальных фибробластов на анодированном титане с нанотрубчатой поверхностью была не выше, чем на необработанном металле. Количество секретируемого проколлагена I, а также уровень отложения фибриллярного коллагена на обработанном и необработанном титане также практически не имели достоверных различий. Это позволяет предполагать, что анодирование поверхности имплантата не будет приводить к стимуляции формирования фиброзной капсулы при его интеграции в костную ткань. При этом количество адсорбированных на анодированной поверхности неколлагеновых белков было существенно выше, чем на неанодированной, что может являться дополнительным фактором, способствующим адгезии остеобластов. 2. Уровень секреции фибробластами провоспалительного IL-6 на обоих типах титановой поверхности практически не различался. В то же время, количество секретируемого хемокина IL-8/CXCL8, являющегося аттрактором нейтрофилов, было выше на анодированной поверхности, что может рассматриваться как предпосылка к усилению воспалительной реакции при имплантации материала с поверхностью из нанотрубок.

About the authors

F. A Fadeyev

Institute of Medical Cell Technologies

Email: fdf79@mail.ru
Ekaterinburg, Russia

Y. Y Khrunyk

Ural Federal University; B.N. Eltsin Institute of High Temperature Electrochemistry UB of the RAS

Email: fdf79@mail.ru
Ekaterinburg, Russia

S. V Belikov

Ural Federal University

Email: fdf79@mail.ru
Ekaterinburg, Russia

D. V Lugovets

Institute of Medical Cell Technologies

Email: fdf79@mail.ru
Ekaterinburg, Russia

O. V Gubaeva

Institute of Medical Cell Technologies

Email: fdf79@mail.ru
Ekaterinburg, Russia

S. L Leontyev

Institute of Medical Cell Technologies

Email: fdf79@mail.ru
Ekaterinburg, Russia

S. V Sazonov

Institute of Medical Cell Technologies

Email: fdf79@mail.ru
Ekaterinburg, Russia

A. A Popov

Ural Federal University

Email: fdf79@mail.ru
Ekaterinburg, Russia

References

Supplementary files