Effects of inhibition of glycogen synthase kinase 3p on neuromuscular synaptic transmission in transgenic mice with model of alzheimer's disease

Full Text

Введение В последнее время появились данные о том, что важную роль в патогенезе многих нейродегенеративных заболеваний играет нарушение функционирования синапсов [1]. При болезни Альцгеймера синаптическая дисфункция наблюдается задолго до массовой гибели нейронов и диагностирования других патологических признаков, что дает основание называть этот недуг «синаптической патологией» [2, 3]. Ключевыми признаками синаптической патологии в гиппокампе при болезни Альцгеймера являются нарушение процессов нейросекреции, нарушение баланса между долговременной потенциацией и долговременной депрессией, снижение количества синапсов и уровня синаптических белков [3, 4]. При Альцгеймеровской нейропатологии помимо дисфункции центральных синапсов может нарушаться периферическая синаптическая передача: у APP/PS1 трансгенных мышей была выявлена дисфункция нервно-мышечных синапсов, проявляющаяся в снижении квантового состава потенциалов концевой пластинки (ПКП), усилении депрессии амплитуды ПКП при длительной высокочастотной стимуляции и увеличении времени рециклирования синаптических везикул [5]. Коррекция синаптической дисфункции может представлять собой перспективный подход для разработки способов патогенетической терапии болезни Альцгеймера. Одним из ключевых «игроков», регулирующих синаптические функции, чья активность нарушается при болезни Альцгеймера, является киназа гликогенсинтазы 3р (GSK-3P), что позволяет рассматривать ее как потенциальную мишень при разработке таргетной терапии данного заболевания [6]. Выявлена повышенная активность GSK-3P в различных областях мозга пациентов с болезнью Альцгеймера и трансгенных мышей с моделью данной патологии [7-9]. Известно о вовлечении GSK-3P в процесс фосфорилирования тау-белка и продукции р-амилоидного пептида [6, 10, 11], что еще более повышает интерес к этой молекуле как мишени терапевтического воздействия при болезни Альцгеймера. Целью настоящей работы является изучение эффектов ингибирования GSK-3P на нервно-мышечную синаптическую передачу в модели болезни Альцгеймера. Гены & Клетки, том XV, № 4, 2020 58 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и методы Дизайн эксперимента Для изучения эффектов ингибирования GSK-Эр на нервно-мышечную синаптическую передачу в качестве модели болезни Альцгеймера была использована трансгенная линия мышей В6СЗ-Tg(APP695)85Dbo Tg(PSENI)85Dbo, характеризующаяся синтезом химерного мышиного или человеческого белка предшественника амилоида и мутантного человеческого пресенелина-1 (APP/PS1 мыши). Обе мутации связывают с ранней формой болезни Альцгеймера. Начиная с 6-7 мес. возраста, в мозге APP/PS1 мышей обнаруживают отложения р-амилоидного пептида - одного из основных признаков болезни Альцгеймера. За 2 недели до начала экспериментов APP/ PS1 мышей получали из биоресурсной коллекции Питомника лабораторных животных Филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и транспортировали в виварий Казанского ГМУ. Животных содержали в стандартных условиях вивария, все необходимые манипуляции выполняли в соответствии с Директивой ЕС 2010/63/ ЕС по экспериментам на животных, Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (2003) и были одобрены этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (протокол № 3 от 6.10.2015). Для проведения экспериментов мышей усыпляли путем внутрибрюшинного введения хлоралгидрата (300 мг/кг; Panreac, Испания), перерезали сонные артерии и выделяли нервно-мышечные препараты диафрагмы. Препараты помещали в ванночку с перфу-зионным раствором следующего состава (мМ): NaCl - 125,0; KCl - 2,5; CaCl2 -2; NaH2PO4 - 1,0; MgCl2 - 1,0; глюкоза - 11,0 (все реактивы фирмы Sigma-Aldrich, США). рН раствора поддерживали на уровне 7,2-7,4, температуру - на уровне 200С. Раствор аэрировали карбогеном (95% О2, 5% СО2). Эксперименты были проведены на APP/PS1 мышах в возрасте 8-9 мес. (n=27). На препаратах 14 мышей изучали эффекты ингибирования активности GSK-Зр под действием AR-A014418 (опытная группа): анализировали электрофизиологи-ческие показатели нервно-мышечной синаптической передачи и оценивали процессы экзо- и эндоцитоза в поверхностно расположенных нервных окончаниях. Препараты 13 мышей служили контролем. Модуляция активности GSK-Эр Для ингибирования активности GSK-Зр применяли селективный ингибитор AR-A014418 (N-[(4-Methoxyphenyl)methyl]-N'-(5-nitro-2-thiazolyl)urea) (Sigma-Aldrich, США). AR-A014418 является одним из наиболее перспективных блокаторов GSK-Зр, который может быть внедрен в клиническую медицину [12]. AR-A014418 добавляли в перфузионный раствор в концентрации 1 |jM, эффекты AR-A014418 анализировали через 60 мин. после подачи вещества. Анализ электрофизиологических показателей нервно-мышечной синаптической передачи APP/PS1 мышей Эксперименты проводили на нервно-мышечных препаратах диафрагмы мышей. При регистрации ПКП для предотвращения сокращений за 50 мин. до начала стимуляции двигательного нерва мышцу поперечно рассекали. ПКП и миниатюрные потенциалы концевой пластинки (МПКП) регистрировали при помощи усилителя биопотенциалов Axoclamp 900A (Axon Instruments, США), соединенного с аналого-цифровым преобразователем LA-USB (ООО «Руднев-Шиляев», Россия) и персональным компьютером. Отведение ПКП и МПКП осуществляли внутриклеточно вблизи нервных окончаний при помощи стеклянных микроэлектродов (4-9 МОм), заполненных раствором KCl. Синаптические сигналы записывали и анализировали при помощи оригинальной программы Elph (разработчик - к. б. н. Захаров А.В.). Для определения частоты МПКП записывали 50-100 сигналов. ПКП регистрировали при низкочастотной (0,1 Гц) и высокочастотной (5, 20, 50 Гц) стимуляции нерва. Квантовый состав ПКП вычисляли методом анализа дисперсии амплитуд ПКП. Анализ экзо- и эндоцитоза в поверхностно расположенных нервных окончаниях Для оценки процессов экзо- и эндоцитоза в поверхностно расположенных нервных окончаниях использовали флуоресцентный краситель FM 1-43 (N-(3-(triethylammonium) propyl)-4-(4-dibutilaminostyrylp yridiniumdibromide) (6 JМ, Invitrogen, США), способный обратимо связываться с пресинаптической мембраной и захватываться внутрь нервными окончаниями при эндоцитозе [13, 14]. Процессы эндоцитоза оценивали по «загрузке», а процессы экзоцитоза-по «выгрузке» красителя FM 1-43. Загрузку красителя FM 1-43 вызывали высокочастотной стимуляцией препарата (20 Гц) в присутствии красителя в растворе, при этом выраженность загрузки FM 1 -43 отражала интенсивность процессов эндоцитоза синаптических везикул. Выгрузку красителя FM 1-43 из предварительно загруженных препаратов осуществляли путем высокочастотной стимуляции (20 Гц, 10 мин.), что приводило к снижению флуоресценции. Мышечные сокращения в процессе выгрузки блокировали путем добавления d-тубокурарина (5-10 JМ; Sigma-Aldrich, США). Флуоресценцию регистрировали на флуоресцентном микроскопе Olympus BX51W1 (Olympus, Япония), оснащенном конфокальным сканирующим диском DSU, ртутной лампой 100 Вт, черно-белой CCD-камерой Hamamatsu OrcaR2. Оптика для регистрации свечения включала объектив Olympus LUMPlanFl х60 (0,9 NA) и комплект светофильтров Olympus U-MNB2. Анализ свечения производили с использованием программ CellP и ImageJ, интенсивность свечения нервных окончаний рассчитывали как разность между свечением нервного окончания и близкорасположенного участка мышечного волокна. Абсолютно белый цвет принимали за 255 условных единиц. Статистический анализ Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Статистическую значимость (достоверность) различий оценивали по t-критерию Стьюдента, отличия считали достоверными при р<0,05. Результаты Эффекты AR-A014418 на электрофизиологические показатели нервно-мышечной синаптической передачи APP/PS1 мышей Квантовый состав ПКП у APP/PS1 мышей составил 94,8± 12,3, время нарастания и полуспада Гены & Клетки, том XV, № 4, 2020 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 59 APP/PS1 APP/PS1+ AR-A014418 Время, мин * I Рис. 1. Экзо- и эндоцитоз синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях APP/PS1 мышей под влиянием AR-A014418: А - свечение препаратов, отражающие «загрузку» красителя FM 1-43 у APP/PS1 мышей в стандартном перфузионном растворе и на фоне действия AR-A014418 (1 |jM); Б - динамика «выгрузки» красителя FM 1-43 из нервных терминалей APP/PS1 мышей в стандартном перфузионном растворе (черные квадраты) и на фоне действия AR-A014418 (1 мМ) (белые кружки); * - статистические значимые различия окончаний. На 9 и 10 мин. стимуляции наблюдали более выраженное снижение интенсивности свечения по сравнению с контрольными препаратами. Так, через 3 мин. от начала выгрузки интенсивность свечения составила 49,1 ± 4,5% (достоверно не отличается от контроля), а через 10 мин. от начала выгрузки - 22,4 ± 3,2% (достоверно ниже по сравнению с контролем) от исходных значений (n=6) (рис. 1Б). ПКП - 485,2 ± 23,8 мкс и 2168,5 ± 232,4 мкс, соответственно (n=8). Амплитуда МПКП у APP/PS1 мышей равнялась 0,65 ± 0,07 мВ, частота - 1,2 ± 0,6 с-1, время нарастания и полуспада МПКП - 433,1 ± 88,2 мкс и 1581,2 ± 127,4 мкс, соответственно (n=8). При стимуляции с частотой 5 Гц у APP/PS1 мышей наблюдали характерный двухфазный спад амплитуды ПКП: к 7 сигналу амплитуда ПКП составила 76,7 ± 2,2%, затем была отмечена относительная стабилизация и медленное постепенное снижение амплитуды до 64,4 ± 1,6% к 500 сигналу (n=8). При стимуляции с частотой 10 Гц у APP/PS1 мышей наблюдали снижение амплитуды ПКП до 74,5 ± 1,8% к 9 сигналу с последующим медленным спадом до 69,4 ± 1,9% от исходных значений к 500 сигналу (n=8). При стимуляции с частотой 20 Гц у APP/PS1 мышей происходило начальное снижение амплитуды ПКП к 7 сигналу до 73,4 ± 2,2% от исходных значений с последующим спадом до 58,1 ± 2,8% к 500 сигналу (n=8). При стимуляции с частотой 50 Гц у APP/PS1 мышей наблюдали резкий начальный спад и затем постепенное снижение амплитуды ПКП - к 25 сек. до 35,3 ± 3,2% от исходных значений (n=8). Аппликация AR-A014418 (1 мМ) не оказывала статистически значимого влияния на амплитудно-временные параметры и квантовый состав ПКП при редкой стимуляции, на динамику амплитуды ПКП при высокочастотной стимуляции (5, 10, 20, 50 Гц) (n=7), а также на амплитудно-временные параметры и частоту МПКП (n=7). Эффекты AR-A014418 на процессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях APP/PS1 мышей Для подбора протоколов загрузки красителя FM 1-43, вызывающего выброс одинакового количества квантов нейромедиатора у APP/PS1 мышей на фоне действия AR-A014418 (1 мМ) и в его отсутствии, был проведен анализ кумулятивных кривых нейросекреции. При стимуляции с частотой 20 Гц в течение 60 сек. в нервно-мышечном синапсе APP/PS1 мышей на фоне действия AR-A014418 выделялось около 118 000 квантов, что соответствует количеству квантов, выделяемому в нервно-мышечном синапсе APP/ PS1 мышей в контроле при стимуляции с частотой 20 Гц в течение 45 сек. Высокочастотная стимуляция (45 сек., 20 Гц) препарата нервно-мышечной ткани APP/PS1 мышей в присутствии красителя FM 1-43 приводила к «загрузке» красителя в нервные окончания, что проявлялось в виде появления округлых светящихся пятен в области нервных окончаний, отражающих скопления синаптических везикул, прошедших цикл экзо-эндоцитоза (рис. 1А). Интенсивность свечения нервных терминалей у APP/ PS1 мышей составила 30,1 ± 1,1 усл. ед. (n=99). Длительная высокочастотная стимуляция (20 Гц, 10 мин) «загруженных» препаратов вызывала экспоненциальное снижение интенсивности свечения нервных терминалей, достигая 51,9 ± 3,0% и 31,8 ± 0,9% от исходного значения к 3 и 10 мин. от начала стимуляции (n=6) (рис. 1Б). Для оценки эффектов ингибирования GSK3P препарат начинали перфузировать раствором с AR-A014418 (1 мМ) за 60 мин. до начала загрузки красителя FM 1-43 в нервные окончания. Высокочастотная стимуляция (20 Гц, 60 сек.) нервномышечных препаратов APP/PS1 мышей на фоне действия AR-A014418 приводила к загрузке красителя в нервные окончания, и картины свечения нервных терминалей были аналогичны таковым в контроле (рис. 1А). Интенсивность свечения терминалей составила 32,0 ± 1,4 усл. ед. (n=99), что достоверно не отличается от таковой у APP/PS1 мышей в контроле. Высокочастотная стимуляция (20 Гц, 10 мин.) «загруженных» препаратов вызывала экспоненциальное снижение интенсивности свечения нервных Таким образом, аппликация AR-A014418 не оказывала влияния на процессы эндоцитоза, однако умеренно усиливала процессы экзоцитоза синаптических везикул, о чем свидетельствовала более выраженная «выгрузка» красителя из нервных окончаний в конце стимуляцион-ного шлейфа (на 9-10 мин.). Гены & Клетки, том XV, № 4, 2020 60 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Обсуждение Ранее было доказано, что к ключевым проявлениям дисфункции нервно-мышечных синапсов у APP/ PS1 мышей относятся снижение квантового состава ПКП, усиление депрессии амплитуды ПКП при длительной высокочастотной стимуляции (50 Гц) и возрастание времени рециклирования синаптических везикул [5]. Учитывая важную роль GSK-3P в развитии синаптических нарушений при Альцгеймеровской нейропатологии [15], можно предполагать участие дизрегуляции GSK-3P в развитии дисфункции нервно-мышечных синапсов в модели болезни Альцгеймера. Нами было установлено, что ингибирование GSK-3P под действием AR-A014418 (1 pM) у APP/PS1 мышей не влияло на электрофизиологические показатели нервно-мышечной синаптической передачи, однако приводило к умеренному усилению процессов экзоци-тоза синаптических везикул в двигательных нервных терминалях в условиях длительной высокочастотной активности. Несмотря на то, что мы не обнаружили влияния AR-A014418 (1 pM) на уровень вызванной нейросекреции, стимулирование процессов экзоци-тоза синаптических везикул под действием данного вещества, выявленное в экспериментах с применением флуоресцентного красителя FM 1 -43, может способствовать поддержанию надежности нервномышечной синаптической передачи при высокочастотной активности в условиях сниженного (по сравнению с мышами дикого типа) исходного квантового состава ПКП у APP/PS1 мышей. Данный эффект AR-A014418 может объясняться более активным участием везикул рециклирующего и(или) резервного пула в процессах нейросекреции при длительной высокочастотной активности синапса. Механизм влияния AR-A014418 на экзоцитоз синаптических везикул, возможно, связан с изменением функционирования одного или нескольких пресинаптических белков в результате ингибирования GSK-3p. Важно отметить, что усиление экзоцитоза синаптических везикул за счет ингибирования GSK-3P может иметь корригирующее влияние на нервно-мышечную синаптическую дисфункцию у APP/PS1 мышей. Полученные результаты будут полезны для применения в исследованиях, направленных на разработку терапевтических стратегий при болезни Альцгеймера.

About the authors

M. A Mukhamedyarov

Kazan State Medical University

P. N Grigoryev

Kazan State Medical University

E. A Ushanova

Kazan (Volga Region) Federal University

A. L Zefirov

Kazan State Medical University

References

Supplementary files