New data on spontaneous oncogenetic transformation of "adult" human bone marrow stem cells in vitro

Full Text

Широкое начало клинических испытаний методов терапии прогениторными и стволовыми клетками костного мозга при различных заболеваниях требует уверенности в их безопасности прежде всего - онкогенной. На потенциальный риск канцерогенеза из «взрослых» стволовых клеток человека после их трансплантации указывает тот факт, что они экспрессируют общие маркёры с эмбриональными стволовыми клетками и многими злокачественными линиями [1]. Кроме того, из многих злокачественных новообразований человека были выделены и охарактеризованы так называемые опухоль-инициирующие клетки, которые, как оказалось, имеют общие характеристики [маркёры] с нормальными «взрослыми» стволовыми клетками [2].

Daniel Rubio описал популяцию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [ММСК] человека, выделенную из подкожной жировой клетчатки, демонстрирующую злокачественные характеристики [3]. В культуре С013⁺/ CD9O⁺/CD1O5⁺/CD1O6⁺ ММСК после двухмесячного пассирования[более 20 делений]стали появляться трансформированные клетки, характеризующиеся высокой способностью к канцерогенезу у 100% SCID-мышей-реципиентов [4]. Данные были тщательно проверены путём повторов экспериментов для других аликвот одного и того же образца. Кроме того, материал брали от пациентов, подвергшихся аппендэктомии и не страдающих злокачественными новообразованиями. Всё это позволило исключить перекрёстную контаминацию культур злокачественными клетками [3, 4]. Авторы работы указывают, что нужно провести широкомасштабные и более детальные исследования, поскольку такая спонтанная трансформация не являлась универсальной и наблюдалась не во всех образцах. По-видимому, это связано с высокой гетерогенностью популяции ММСК, хотя эксперименты дали схожие результаты у мыши и у человека [3, 8].

Работа, выполненная в Johns Hopkins University [Baltimore, USA], опубликованная в журнале Cytotherapy, подтверждает данные, полученные группой Rubio, и позволяет более детально взглянуть на проблему. Исследователи попытались ответить на вопрос - насколько безопасен феномен высокой пластичности [мультипотентности] ММСК в контексте их клинического применения?

ММСК выделяли из образцов костного мозга человека, полученных от нормальных доноров, используя высокую способность клеток к адгезии. На 3-м пассаже клетки имели типичную морфологию ММСК, фенотип СС105⁺/ CD73⁺/CD13⁺/CD90⁺/CD34-/CD45~/CD133- и легко подвергались адипо- и остеогенной дифференцировке в индукционной среде.

В монослойной культуре ММСК одного из образцов с 3-го пассажа появлялись колонии клеток, отличающиеся морфологически и интенсивно делящиеся при дальнейшем субкультивировании. Иммунофенотипически эти клетки характеризовали как CD133⁺/CD34-/CD38~/CD117-/CD45-/CD1O5-/CD13-/CD73⁺/CD9Olow/CD31~/ABCG- BCRP⁺/HLA-DR⁺-/VEGFR1~/VEGFR2⁺-. По сравнению с исходными, эти CD133⁺ клетки легко клонировались, теряли способность к «контанктному торможению», имели в 2 раза меньшее время удвоения и характеризовались высоким уровнем теломеразной активности. Эти клоны легко поддерживались в культуре около года без каких-либо признаков старения. Кариотипический анализ клонов [на 5-м, 7-м и 13-м пассажах] выявил множественные хромосомные аномалии, характерные для злокачественных клеток.

CD133⁺ клетки вызывали канцерогенез [преимущественно в лёгких, печени и канцероматоз брюшины] у облучённых NGD/SCID мышей через 4-6 недель после интраперитонеальной и внутривенной трансплантации 2,5-10 млн клеток в10из13ивЗиз12 случаев соответственно, и у 100% животных - через 8 недель.

Таким образом, авторы подтвердили данные о том, что нормальные ММСК человека способны к спонтанной онкогенетической трансформации в культуре. При увеличении числа пассажей в культуре ММСК появляются клоны, характеризующиеся всеми признаками злокачественности. В отличие от работы Rubio, в данном исследовании такие клетки появлялись уже на 3-м пассаже и проявляли типичные признаки злокачественности с 5-7 пассажа, однако, такие клоны были выделены только из одного образца ядросодержащих клеток костного мозга, и остаётся неясным, насколько они универсальны и присутствуют ли в остальных образцах.

Основным отличительным признаком этих клеток от исходных [1-2 пассажи] была высокая экспрессия С0133⁺ и утрата экспрессии типичных маркёров, чаще всего описываемых у ММСК - CD105, CD13, CD90. Интересно, что в работе Rubio трансформированные клетки также теряли исходно высокую экспрессию CD105 и CD90, однако данных по CD133 не приводится. Отсюда можно предположить, что, возможно, речь идёт об одной и той же популяции клеток, описанной среди ММСК как подкожной жировой клетчатки, так и костного мозга. В обеих работах использовались среды без факторов роста, поэтому условия культивирования можно считать более-менее сходными.

Происхождение туморогенной популяции стволовых клеток среди пластик-адгезивных мононуклеарных клеток остаётся неясным. Популяция CD133⁺ [имеющая также фенотип ММСК] туморогенных клеток могла изначально присутствовать в образцах или же появиться в культуре при пассировании гетерогенной популяции ММСК. Авторы настоящей работы указывают на большую вероятность второй теории, поскольку до 3-го пассажа экспрессия CD133 была недетектабельна. Интересно, что фенотип трансформированных клеток CD133'/CD31 /VEGFR2' может указывать на то, что они происходят из эндотелиальных прогениторов. Чтобы выяснить этот вопрос, в будущих экспериментах придётся исключать различные популяции из общей гетерогенной пластик-адгезивной фракции, демонстрирующей свойства ММСК, методом сортинга и последующего их анализа в долговременной культуре. Тем не менее, проблема возникновения злокачественных опухолей из CD133⁺ клеток человека не нова и довольно неплохо изучена в настоящее время [1, 7]. Данная работа только подтверждает теорию участия этих клеток в канцерогенезе и указывает на то, что, возможно, эти клетки - самые «молодые» в организме человека и обладают максимальной «стволовостью».

Общая биологическая способность ММСК к онкогенетической трансформации остаётся дискутабельной. Так, было показано, что ММСК костного мозга человека легко иммортализуются и после 256 удвоений дают рост опухолей in vivo в 100% случаев [8]. С другой стороны, группа Kassem указывает, что при длительном пассировании ММСК, выделенных из костного мозга человека, они не получили никаких признаков иммортализации после 40 удвоений [4, 6]. Интересно, что ММСК мыши также подвержены спонтанной трансформации в культуре и демонстрируют сходную [с человеческими] злокачественность in vivo [3, 8]. В дискуссии к статье Rubio Kassem говорит о том, что результаты таких работ должны широко обсуждаться среди специалистов, поскольку речь идёт о широком применении этих клеток в клинике. Необходимы дополнительные исследования с более широким набором методов, например ДНК-отпечатков и микросателлитов [4].

Основной проблемой в интерпретации результатов работ нескольких групп исследователей может стать различие протоколов по выделению, культивированию и характеристике ММСК. Тем не менее, на сегодняшний день ясно, что при пассировании гетерогенной популяции пластик- адгезивных мононуклеарных клеток костного мозга и подкожного жира человека, обладающих характеристиками ММСК, появляются трансформированные клетки, способные к канцерогенезу in vivo. Эта работа ещё раз показывает, что клинические исследования по терапевтической эффективности ММСК преждевременны, и им должно предшествовать более детальное изучение онкогенетической безопасности такой терапии. Поскольку клинические испытания, использующие очищенные CD133⁺ клетки, в настоящее время уже проводятся в разных странах мира, авторы работы призывают, как минимум, проверять кариотип клеток перед введением.

About the authors

A. V. Bersenev

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

References

Supplementary files