Fusion-phenomenon in normal histogenesis and in pathology: part 1

Abstract

Various processes happening in human organism depend on cell fusion (also called "fusion-phenomenon”). This review focuses on role of this phenomenon in the histogenesis of different tissues and molecular mechanism of the cell fusion. The Part 1 describes fusion-phenomenon in the normal, physiological conditions.

Full Text

Введение Fusion-феноменом или клеточным слиянием называется процесс объединения двух или более клеток в одну более крупную многоядерную структуру - симпласт. Этот процесс в ходе нормального и патологического гистогенеза может быть обнаружен у многих организмов, включая человека. Слияние является одним из ключевых этапов цито- и гистогенеза при формировании поперечнополосатой скелетной мышечной ткани, синцитиального слоя трофобласта (синцитио-трофобласт). Кроме того, даже оплодотворение также можно рассматривать как одно из проявлений fusion-феномена [1]. Значение слияния клеток не ограничивается эмбриональным развитием, данное явление происходит во время регенерации и роста скелетных мышц [2], в ходе образования остеокластов [3]. Fusion-феномен является частью патоморфогенеза при некоторых заболеваниях, таких как гранулематозное воспаление - образование гигантских многоядерных клеток; вирусных инфекций - многие вирусы посредством своих белков вызывают слияние клеток; опухоли - происходит слияние злокачественно трансформированных клеток друг с другом и с нормальными клетками. Одно из первых упоминаний о возможности слияния клеток встречается в монографии Теодора Шванна (1839) «Микроскопические исследования о соответствии в структуре и росте животных и растений» (рис. 1) [4]. В частности, он выделяет первичные и вторичные клетки, последние образуются путем объединения первичных. Такой механизм был предложен им для описания формирования мышечных волокон: «Однако возникает вопрос, как развивается последняя упомянутая форма мышечных волокон, т. е. их основная форма. Она представляла собой цилиндр, по всей вероятности полый и предположительно закрытый на концах, там где мышечные волокна разом заканчиваются притупленным, закругленным краем на сухожилиях. В этом цилиндре ядра клеток лежат рядом друг с другом на малых расстояниях. Является ли цилиндр удлиненной клеткой, в которой ядра составляют основу новых, но не развивающихся клеток, или же являются ядрами остатков клеток, которые путем слияния друг с другом и резорбции перегородок образуют цельное волокно или цилиндр? Другими словами, было ли волокно создано слиянием клеток? Вряд ли можно сомневаться в том, что каждый примитивный пучок мышц является вторичной клеткой, образованной слиянием первичных круглых исходных клеток, которые располагались в ряд друг за другом» (стр. 161-164). Механизмы слияния разных клеток сильно отличаются друг от друга, однако во всех случаях выделяют пять основных этапов этого процесса (рис. 2): 1. Дифференцировка. В ходе реализации своей генетической программы, либо же в результате воздействия каких-либо специфических молекул на рецепторы, клетки начинают экспрессировать белки, которые участвуют в процессе слияния. 2. Миграция. Клетки сближаются под влиянием хе-мотаксических факторов. 3. Распознавание мембраны другой клетки и прикрепление к ней. На этом этапе взаимодействие между клетками осуществляется с помощью большого количества рецепторов и молекул межклеточной адгезии. 4. Слияние мембран и образование отверстия (поры) в плазмалемме. Взаимодействие двух мембран начинается в тот момент, когда они сближаются на расстояние ~10 нм [4]. На первом этапе клеточная мембрана деформируется в результате взаимодействия мембранного фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата с ионами кальция [3, 5]. Это приводит к тому, что наружные слои мембран приближаются друг к другу, соединяются и формируют липидный мостик (fusion stalk) между двумя клетками. Мостик, поначалу очень тонкий, расширяется в радиальном направлении, формируя двуслойную структуру (hemifusion diaphragm), образованную двумя внутренними липидными слоями. Затем эта диафрагма разрывается и образуется отверстие в мембранах (пора), которая расширяется за счет деполимеризации актиновых филаметов [4]. Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 14 ОБЗОРЫ Рис. 1. Изображения некоторых страниц из монографии Т. Шванна «Микроскопические исследования о соответствии в структуре и росте животных и растений» (1839): титульный лист; раздел «Класс 5. Ткани, формирующиеся из клеток, стенки и полости (содержимое) которых сливаются друг с другом»; иллюстрации: 1 - мышца спины 3,5-дюймового плода свиньи; 2 - то же после обработки уксусной кислотой; 3 - мышца (волокно) плеча 7-дюймового плода свиньи; 4 - мышцы майского жука; 5 - мышечный пучок щуки; 6 - седалищный нерв 4-дюймового плода свиньи; 7 - мышца плеча 4-дюймового плода свиньи; 11 - капилляры хвоста головастика Некоторые этапы слияния мембран, а именно удаление гидратной оболочки, окружающей клетки, а также образование двуслойной диафрагмы и расширение отверстия в мембране, требуют преодоления значительных энергетических барьеров, следовательно, не могут протекать спонтанно. В частности, в указанных процессах принимают участие фузогенные белки (фузогены) [4]. У млекопитающих, включая человека, описаны два фузогена - синцитины 1 и 2. Эти белки принимают участие в формировании синцитиотрофобласта [1]. Синцитин-1 присутствует на яйцеклетке, а его рецептор ASCT2 - на сперматозоиде [6]. Также экспрессия син-цитина-1 выявлена в остеокластах [7] и миобластах [8]. Синцитин-2 обнаружен только в трофобласте, его рецептором является MFSD2a [9]. Синцитины представляют собой гликопротеины, состоящие из трех доменов: внеклеточного, трансмембранного и внутриклеточного. Благодаря мотиву «лей-циновая застежка-молния» в трансмембранном домене синцитин-1 образует тример. Взаимодействие внеклеточного домена с рецептором ASCT2 приводит к серии конформационных изменений, которые завершаются проникновением участка синцитина, называемого фу-зогенным доменом, в мембрану другой клетки (рис. 3). После этого синцитиновый тример осуществляет изменение конформации, приводящее к слиянию двух мембран и образованию небольшого отверстия между ними, которое затем расширяется [5]. Существует и альтернативная модель слияния мембран. Согласно ей, основную роль в данном случае играют белковые трансмембранные каналы, которые взаимодействуют с аналогичными каналами на другой мембране [5]. Завершающий этап - образование гибридной клетки: происходит смешивание цитоплазм и приобретение нового фенотипа и профиля экспрессии генов [10]. Образовавшаяся гибридная клетка может иметь одно ядро, в таком случае она будет носить название синка-рион, либо несколько ядер - гетерокарион. В зависимости от типа клеток, между которыми произошло слияние, различают гомотипическое слияние - между одинаковыми клетками (например, слияние моноцитоподобных клеток с образованием остеокластов) и гетеротипиче-ское - между разными клетками (например, слияние сперматозоида и яйцеклетки) [11]. Оплодотворение как процесс слияния клеток Оплодотворение является особым частным случаем fusion-феномена, который отличается от других типов слияния рядом особенностей [1]. Во-первых, в оплодотворении принимают участие две гаплоидные клетки, в то время как во всех остальных случаях сливаются либо диплоидные, либо полиплоидные. Во-вторых, после оплодотворения дальнейшие слияния становятся невозможны, так как реализуются механизмы, блокирующие полиспермию. Во всех остальных случаях клетки способны проходить через множество событий слияния и формировать крупные многоядерные структуры. Непосредственно перед оплодотворением сперматозоиды претерпевают функциональные изменения, совокупность которых называется капацитацией. Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 ОБЗОРЫ 15 Рис. 2. Схема взаимодействия мембран при слиянии клеток. Пояснения в тексте. Из [5], с изм. Рис. 3. Схема конформационных изменений синцитинового тримера, приводящих к слиянию клеток: красный - ASCT2, розовый - фузогенный домен синцитина; синий - домен, связывающий рецептор; голубой - остальные домены. Пояснения в тексте. Из [5] с изм. У сперматозоидов увеличивается текучесть мембраны из-за эффлюкса холестерола, изменяется мембранный потенциал [12]. Затем происходит акросомная реакция, которая заключается в слиянии цитоплазматической мембраны сперматозоида и мембраны акросомы и последующем выбросе протеолитических ферментов. Данное слияние обеспечивается белком экваторином [13]. Акросомная реакция активируется контактом с блестящей оболочкой (zona pellucida), изменением концентрации прогестерона, либо протекает спонтанно [14]. Выделяемые при этом ферменты разрушают блестящую оболочку, что позволяет сперматозоиду слиться с яйцеклеткой. Контактное взаимодействие гамет происходит на специализированных участках мембраны - экваториальной зоне сперматозоида и ворсинчатой зоне яйцеклетки [15]. Существует гипотеза, согласно которой на обеих мембранах имеются крупные мультимолекулярные комплексы, взаимодействующие друг с другом [14]. Для описания взаимодействия гамет предложено использовать термин «синапс», по аналогии с иммунологическим синапсом [16]. Среди множества белков, принимающих участие в слиянии (табл. 1), присутствует синцитин-1 и его рецептор ASCT-2, предположительно отвечающие за формирование отверстий в мембране [7, 17]. Точная роль синци-тина-1 в оплодотворении не установлена. Исключительно важную роль в процессе оплодотворения играет белок IZUMO1 - молекула межклеточной адгезии, относящаяся к суперсемейству иммуноглобулинов [18]. Этот белок перемещается с мембраны акросомы в экваториальную область сперматозоида по завершению акросомной реакции [14]. Функция IZUMO1 заключается в связывании белка Juno (фолатный рецептор 4), который расположен на яйцеклетке. IZUMO1 часто ошибочно описывается как фузогенный белок, однако он таковым не является, так как не имеет фузогенного домена, в отличие от истинного фузогена синцитина [19]. Процесс взаимодействия Juno и IZUMO1 протекает в три стадии (рис. 4). На первом этапе Juno распознает молекулу IZUMO1, после чего образовавшийся комплекс рецептор-лиганд димеризуется. Затем белок семейства протеиндисуль-фидизомераз «складывает» молекулу IZUMO1 пополам, погружая её внеклеточный домен в мембрану сперматозоида. После этого конформационного изменения Juno открепляется от рецептора и более не принимает участия в адгезии. Наконец, последняя стадия, заключается в том, что сложенный пополам димер IZUMO1 взаимодействует с пока не идентифицированным рецептором на оолем-ме [20]. Данные конформационные изменения требуются для того, чтобы сблизить мембраны клеток между собой и тем самым снизить необходимый уровень изменения свободной энергии, который требуется для образования липидного мостика между двумя мембранами. На поверхности яйцеклетки имеются CD 81 и CD9 (те-траспанин 28 и 29 соответственно) [16]. Это небольшие мембранные белки, которые структурируют определенные участки мембраны, формируя так называемые домены, обогащенные тетраспанинами, и взаимодействуют с цитоскелетом и сигнальными молекулами [21]. Кроме того, белки этого семейства принимают участие в процессе слияния миобластов [22] и моноцитов [23]. Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 16 ОБЗОРЫ Рис. 4. Схема взаимодействия Juno и IZUMO1. Пояснения в тексте. Из [20] с изм. CD9 принимает участие в процессе оплодотворения, однако его точная функция неизвестна. Показано, что CD9 локализуется на яйцеклетке в области микроворсинок - участке мембраны, в котором происходит слияние [24]. У мышей, нокаутных по гену белка CD9, изменена структура микроворсинок: они короче и тоньше [24]. Другая гипотеза предполагает, что CD9 является кофактором одного из белков адгезии и увеличивает его аффинность к рецепторам [16]. Не исключено также взаимодействие CD9 со специфическими рецепторами сперматозоида [25]. Также, согласно данным компьютерного моделирования, CD9 взаимодействует с инте-гринами, CD49, IZUMO1 и ADAM2 [26, 27] В адгезии сперматозоида к яйцеклетке принимают участие белки семейства интегринов, в частности ин-тегрин a6ß1, находящийся на мембране сперматозоида [17]. Предположительно, рецептором a6ß1 является фертиллин ß (ADAM2) [28]. Таблица 1. Белки слияния половых клеток Сперматозоид Яйцеклетка IZUMO1 Juno Интегрин a6ß1 Тетраспанины 28 и 29 (CD81 и CD9) Синцитин 1 Фертиллин ß (ADAM2) ASCT-2 ASCT-2 После завершения слияния со сперматозоидами происходит кортикальная реакция, в ходе которой яйцеклетка секретирует содержимое кортикальных гранул. Одним из выделяемых белков является овастацин - протеаза, которая расщепляет белок ZP2, входящий в состав блестящей оболочки. Разрушение ZP2 нарушает адгезию сперматозоидов к zona pellucida. Дополнительно происходит удаление Juno c мембраны яйцеклетки посредством везикулярного транспорта, а образующиеся при этом везикулы служат своего рода «ловушками» для других сперматозоидов [16]. Слияние клеток в трофобласте Большое количество клеток в трофобласте сливаются между собой во время плацентации. На 15-21 сутки после оплодотворения образуется синцитиотрофо-бласт - крупная многоядерная структура, покрывающая ворсины хориона [29]. Его функция заключается в инвазии в эндометрий, питании эмбриона и освобождении последнего от метаболитов, газообмене между зародышем и организмом матери и выработке специфических плацентарных гормонов. Синцитиотрофобласт образуется путем слияния клеток цитотрофобласта [5]. В процессе слияния синцитиотрофобласта выделяют несколько этапов. На этапе коммитирования клетка останавливает клеточный цикл и экспрессирует специфические белки, необходимые для слияния. Коммитирование обеспечивается EGF (Epidermal Growth Factor, эпидермальный фактор роста), EGFR (EGF Receptor, рецептор эпидермального фактора роста), GM-CFS (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor, гранулоцитар-но-макрофагальный колониестимулирующий фактор), LIF (Leukemia Inhibitory Factor, ингибирующий фактор лейкемии), MIC-1 (Macrophage Inhibitory Cytokine 1, ингибирующий цитокин макрофагов 1), активином А и хорионическим гонадотропином человека (ХГЧ) [5]. ХГЧ увеличивает транскрипцию генов белков, участвующих в слиянии: синцитинов, коннексина 43, кадгерина Е, а также увеличивает выработку ХГЧ другими клетками, тем самым обеспечивая положительную обратную связь. Механизм действия ХГЧ заключается в стимуляции рецептора LH/CG-R, что приводит к активации аденилатциклазы и протеинкиназы А и в итоге изменяет экспрессию генов белков, участвующих в слиянии. Помимо активирующих веществ, синцитий вырабатывает молекулы, замедляющие процесс слияния. Кандидатами на роль этих факторов являются TGFß (transforming growth factor beta) и TNFa (tumor necrosis factor alpha) [5]. На этапе адгезии происходит образование межклеточных контактов. Адгезионные контакты состоят из Е-кадгерина и кадгерина-11 и участвуют в прикреплении клеток друг к другу [30]. Также Е-кадгерин в ассоциации с сигнальным комплексом ß-катенина обеспечивает формирование плотных и щелевых контактов [31]. В дальнейшем внеклеточный домен Е-кадгерина отщепляется посредством ADAM12 [32]. Другой тип контактов - щелевые контакты - обеспечивают межклеточную коммуникацию - обмен малыми молекулами, ионами и белками. В состав щелевых контактов трофобласта входят коннексин 43, который формирует трансмембранные каналы и эзрин. К эзрину прикрепляется протеинки-наза А, которая, фосфорилируя коннексины, открывает и закрывает щелевые контакты, и тем самым контролирует межклеточную коммуникацию [33]. Плотные контакты имеют в своем составе мембранную гуанилаткиназу ZO-1 (Zona Occludens-1), которая обеспечивает межклеточную адгезию и стабилизацию целевых контактов путем взаимодействия с коннексином-43 [5]. В последнем этапе - слиянии мембран, участвуют фузогенные белки синцитины. Они обеспечивают слияние клеток путем взаимодействия с рецепторами: рецептором синцитина-1 является ASCT2, син-цитина-2 - MFSD2a [34, 35]. Также в плаценте обнаружен ретровирусный белок супрессин, который конкурентно блокирует рецептор синцитина-1, ASCT-2. Предположительно, его роль заключается в торможении слияния вирусов с плацентой и повышении устойчивости фетоплацентарного барьера для патогенов [36]. Слияние миобластов Скелетные мышцы человека состоят из мышечных волокон - симпластов, длина которых достигает нескольких сантиметров. Источником их развития служат стволовые клетки миотома, которые мигрируют в места закладок скелетных мышц. Из стволовых клеток образуются промиобласты, которые претерпевают несколько Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 ОБЗОРЫ 17 i=<ft митотических делений, образуя инициальные миобласты (миобластическая стадия гистогенеза). Инициальные миобласты путем слияния образуют миосимпласты (ми-осимпластическая стадия). Миосимпласты растут как за счет синтеза специфических мышечных белков, так и за счет слияния с миобластами [37]. В результате роста образуются первичные миотубы, которые своими концами прикрепляются к сухожилиям (стадия мышечных трубочек). Популяция миотуб экспрессирует медленную изоформу тяжелых цепей миозина [38]. Вблизи первичных миотуб из промиоцитов формируются новые симпласти-ческие центры, являющиеся предшественниками вторичных миотуб [37, 39]. Из вторичных миотуб формируются быстрые мышечные волокна [40]. Также из промиоцитов образуются клетки-сателлиты [37]. Финальная стадия - стадия мышечных волокон - заключается в росте и созревании мышечных трубочек с образованием зрелых мышечных волокон. Таким образом, две стадии эмбрионального миогенеза из четырех зависят от процессов слияния клеток. Кроме того, после повреждения мышцы происходит активация миосателлитоцитов, образование миобластов, их пролиферация и слияние друг с другом и с мышечными волокнами, за счет чего обеспечивается репаративная регенерация [2, 37]. Таким образом, процесс слияния клеток играет исключительно важную роль в развитии и восстановлении скелетной мышечной ткани. Регуляцию миграции миобластов осуществляют интерлейкин 4, CD164 и маннозный рецептор, усиливающие скорость миграции. Однако простациклин, который замедляет миграцию миобластов, также ускоряет образование мышечных трубочек за счет того, что рецепторам малоподвижной клетки легче связаться с лигандами на мембране других клеток. Таким образом число образующихся мышечных трубочек зависит от соотношения концентраций позитивных и негативных регуляторов скорости миграции [41]. В адгезии миобластов участвуют нефрин [42], инте-грины a9ß1, а2, ß1, и цитоплазматический адаптерный белок киндлин-2 [43, 44], М-кадгерин [45], неогенин, CD36, нефронектин [2], галектин [46]. Контакт первичных миобластов между собой происходит в особых участках мембраны (липидных рафтах), обогащенных фосфатидилсерином и холестеролом [47]. В них располагается стабилин-2, рецептор фосфатилилсерина, роль которого заключается в активации сигнальных путей ELMO/DOCK1/Rac1 и Gulp/Rac1 [48]. Оба сигнальных пути заканчиваются на Rac1, который является членом семейства малых ГТФаз. Данный белок активирует Arp 2/3, который инициирует полимеризацию актина, тем самым управляя цитоскелетом клетки. Также в реорганизацию актинового цитоскелета вовлечен динамин, который взаимодействует с множеством актин-связы-вающих белков, такими как профилин и контрактин [49]. Другим важным компонентом сигнальных путей, регулирующих слияние, является киназа FAK (Focal Adhesion Kinase, киназа фокальной адгезии), активирующаяся в ответ на связывание интегринами внеклеточных рис. 5. Предположительная функция циркулярных подосом. Подосома оказывает механическое воздействие (показано стрелками) на двуслойную диафрагму, ускоряя её формирование и расширение лигандов. Ингибирование аутофосфорилирования FAK во время миогенной дифференцировки никак не влияет на экспрессию генов, связанных с дифференцировкой, но останавливает слияние миобластов, что указывает на наличие важной функции FAK в слиянии [2]. В мышечной ткани млекопитающих обнаружен фузо-ген синцитин-1 [6]. Нокаут гена данного белка приводит к достоверному уменьшению количества мышечной ткани у самцов, но не у самок, что означает, что он не участвует в процессах слияния миобластов у особей женского пола [50]. В настоящее время считается, что именно синцитин-1 ответственен за различия в количестве мышечной ткани у самцов и у самок [51]. Кандидатом на роль фузогена является трансмембранный белок 8с (Tmem8c), также известный как Myomaker, который экспрессируется в скелетных мышцах [52]. Нокаут гена myomaker приводит к гибели мышиных эмбрионов из-за полного отсутствия скелетных мышечных волокон: в тканях обнаруживаются только одноядерные предшественники. Отсутствие Myomaker не влияет на уровень миогенина, миозина и MyoD, что говорит о том, что этот белок выполняет свою функцию после дифферен-цировки и участвует непосредственно в слиянии. Это предположение подтверждается тем, что искусственно вызванная экспрессия Myomaker на мезенхимальных стромальных клетках и на фибробластах придает им способность к слиянию с миобластами [52]. Однако модифицированные таким образом фибробласты сливаются лишь с миобластами, но не между собой, что указывает на присутствие дополнительного фактора слияния именно на миобластах. Таким фактором является белок Gm7325 (Myomegrer/Myomixer/Minion) [53]. Фибробласты с экспрессией Myomegrer способны сливаться с Myomaker-позитивными клетками. В отличие от Myomaker, отсутствие Myomegrer блокирует слияние не полностью. Вероятно, существуют и другие фузогенные факторы [53]. При исследовании миобластов плодовых мушек Drosophila melanogaster в местах контакта миобластов были обнаружены инвазивные подосомы, или инвазио-сомы [54, 55]. Они представляют собой выпячивания мембраны, структурно сходные с подосомами. В организме человека инвазиосомы образуются в процессе трансцитоза лейкоцитов через эндотелий сосудов [56]. Похожие структуры участвуют в слиянии предшественников остеокластов, их предположительная функция заключается в сближении определенных участков клеточных мембран на максимально близкое расстояние, что облегчает формирование липидного мостика, а также в формировании и расширении мембранной поры в месте контакта мембран двух клеток (рис. 5). Вполне вероятно, что в организме млекопитающих слияние миобластов происходит также с помощью инвазивных подосом. Есть несколько свидетельств в пользу данной гипотезы. Во-первых, в процессе слияния мио-бластов участвует большое количество белков, гомологичных таковым у дрозофил [54, 57], что свидетельствует об эволюционной консервативности этого процесса. Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 18 ОБЗОРЫ Во-вторых, существуют описания структур, напоминающих инвазиосомы. Многие авторы описывают филопо-дии и подосомы в культуре мышечных клеток [58-63]. Таким образом, есть основания считать, что инвазиосо-мы участвуют в миогистогенезе человека. Слияние макрофагов Слияние макрофагов приводит к образованию двух типов многоядерных клеток: остеокластов, предназначенных для резорбции костной ткани и гигантских клеток инородных тел и гигантских клеток гранулем. Молекулярные механизмы, обеспечивающие формирование этих клеток, имеют некоторые различия. Формирование гигантских клеток инородных тел происходит под влиянием IL-4 и IL-13 [64]. Их эффект заключается в увеличении экспрессии белков, участвующих в слиянии (таких как е-кадгерин и DC-STAMP) и реализуется при помощи сигнального пути STAT-6 [64-66]. Также слияние усиливается под воздействием гранулоцитарно-макрофа-гального колониестимулирующего фактора, IL-17A и интерферона гамма [67]. Клетки Лангханса в туберкулезных гранулемах образуются под воздействием микобактери-альных гликолипидов - фосфатидил-мио-инозитолманно-зидов и липоманнанов. Эти вещества распознаются при помощи toll-подобного рецептора 2, что приводит к активации сигнального пути, включающего в себя ADAM9 и ин-тегрин ß1 [68]. Кроме этого, макрофаги экспрессируют на своей мембране рецептор TREM2 (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells 2). TREM2 связан с адаптерным белком DAP12 [69], который влияет на экспрессию DC-STAMP и е-кадгерина [68, 70]. Лиганд TREM2 не известен, предположительно, он располагается на макрофагах [68]. Если это предположение верно, то макрофаги способны коммитироваться к слиянию только лишь за счет взаимодействия друг с другом. Следует отметить, что макрофаги в норме сливаются друг с другом без видимых внешних воздействий, и уровень такого слияния снижается при ингибировании активности DAP12 [71]. Для активации формирования остеокластов требуются другой набор цитокинов: RANKL (Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B Ligand) и макрофагальный колониестимулирующий фактор. RANKL связывается со своим рецептором RANK, находящимся на мембране предшественников остеобластов. Это событие приводит к активации фактора транскрипции NFATc1, что влечет за собой изменение транскрипции большого количества генов, происходящее при участии транскрипционного фактора NF-kB [72]. Под управлением RANK находится большая часть белков, влияющих на слияние макрофагов, за исключением CD44, CD47 и ТREM2 [73]. Остеокласты увеличивают количество ядер не только посредством слияния, но и путем незавершенного цитокинеза. Данный процесс также регулируется при помощи RANK [74]. RANK не является единственным активатором NF-kB, другим активатором является цитоплазматический домен CD44 (рецептора гиалуроновой кислоты) [75]. Хемокин CCL2 является одним из факторов хемотаксиса макрофагов, а также способствует их слиянию, влияя на экспрессию DC-STAMP, MMP9 [76, 77]. Предположительно, рецептором CCL2 является мембранный белок DC-STAMP, который регулирует формирование остеокластов и гигантских клеток. Его инактивация приводит к нарушению слияния клеток без нарушения их функций [78]. Существует несколько гипотез насчет функций этой молекулы: участие в перестройках цитоскелета, выбор партнера для слияния, рецепция мембранного или растворимого белка [79]. Наличие в цитоплазматическом домене мотива ITIM указывает на роль DC-STAMP в проведении внутриклеточного сигнала. Кроме того, на остеокластах обнаружен сходный по строению белок OS-STAMP, который также оказывает значительное влияние на их формирование. Вероятно, DS-STAMP и OS-STAMP функционируют как димер [79]. Экспрессия обеих молекул регулируется с помощью STAT-1 и STAT-6 [80]. Адгезия макрофагов друг к другу происходит за счет Е-кадгерина [71] и, вероятно, интегринов. Интегрины-ß опосредуют адгезию макрофагов между собой под действием липидов клеточной стенки бактерий, антитела к интегринам-ß 1 и 2 блокируют слияние in vitro. Однако, есть данные, что интегрины не обеспечивают адгезию макрофагов между собой, а участвуют в их прикреплении к субстрату [81]. Образование остеокластов сопровождается формированием циркулярных подосом. Известно, что в формировании этих структур принимают участие белок Tks5 и тирозинкиназа Src [72]. Перестройки цитоскелета, которые необходимы для образования подосом, включают в себя механизмы, аналогичные процессам в миобластах: фактор обмена гуаниновых нуклеотидов DOCK1 80 активирует малую ГТФазу Rac1 , что приводит к передаче сигнала на белки, связанные с актином [81, 82]. Также в перестройках цитоскелета участвует динамин-2 [83]. Формирование гигантских клеток сопровождается образованием ламел-лоподий, что происходит при участии Rac1 [81]. На этапе слияния плазмалемм происходят изменения в распределении фосфолипидов: в участках контакта фосфатидилсерин перемещается из внутреннего слоя мембраны в наружный [84]. Фосфолипиды распознаются scavenger-рецепторами CD36 [85]. Предположительно, распределение фосфолипидов на мембране изменяется с помощью пуринового рецептора Р2Х7: его непродолжительная активация изменяет расположение фосфати-дилсерина на мембране [86]. Р2Х7 необходим для формирования всех типов гигантских клеток [68]. Наличие фосфатидилсерина на наружном слое мембраны является признаком, по которому макрофаги распознают (с помощью CD36) апоптотические тельца перед их фагоцитозом [87]. Чтобы избежать случайного фагоцитоза, данный процесс блокируется с помощью CD47 и его рецептора SIRP-a (MFR) [88]. В слиянии макрофагов принимают участие белки, влияющие на процесс слияния других клеток. В частности, на макрофагах обнаружена экспрессия синци-тина-1 и коннексина-43, которые работают на поздних стадиях остеокластогенеза [89, 90]. Доказано, что в слиянии участвует ADAM12, однако функция этого белка не ясна [91]. Тетраспанины CD9 и CD81 тормозят образование гигантских клеток из макрофагов, хотя усиливают слияние миобластов и процесс оплодотворения [1 7, 92]. Предположительно, эти тетраспанины оказывают ингибирующий эффект на матриксную металлопротеазу ММР9 [93], которая отщепляет внеклеточные домены различных мембранных белков, переводя их в активную форму, либо способствуя максимальному сближению мембран [76]. Примечательно, что одновременный нокаут CD9 и CD81 способствует значительному увеличению уровня слияния. Другой тетраспанин CD63, напротив, способствует слиянию макрофагов [93]. гетеротипическое слияние клеток костномозгового происхождения Костный мозг является источником клеток, способных сливаться с множеством других видов клеток человеческого организма. Стромальные клетки костного мозга способны сливаться с миобластами [94], Гены & Клетки Том XIII, № 2, 2018 ОБЗОРЫ 19 гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), предположительно, сливаются с гепатоцитами [95] и энтероцита-ми [96], а также между собой [97]. К слиянию с кардиоми-оцитами, нейронами Пуркинье и гепатоцитами способны как клетки миелоидного ряда, так и лимфоциты [98]. Слияние клеток, образовавшихся в костном мозге, с клетками печени было подтверждено во время экспериментов на мышах с мутацией в гене Fah (фумарил-ацетоа-цетат-гидролаза): после пересадки костного мозга от здоровой мыши к мутанту, в гепатоцитах обнаруживалась экспрессия Fah, а при пересадках от самцов к самкам в некоторых гепатоцитах появлялась Y-хромосома [99]. Следует отметить, что, хотя у взрослого человека 30-40% гепатоцитов являются полиплоидными, большая их часть образуется из-за нарушения цитокинеза, а не путем слияния [100]. Незначительное количество многоядерных гепатоцитов (менее 1 клетки на 30 000 000) образуются в результате гомотипического слияния [101]. Однако, некоторые исследователи [102] отрицают возможность слияния ГСК с гепатоцитами. По одной из версий, данное слияние происходит спонтанно из-за того, что у модельных животных мембрана гепатоцитов была повреждена токсическими агентами, которые использовались для изучения процессов повреждения и регенерации печени. Кроме того, это явление обнаружено только у модельных животных, но не у человека. Другой вид клеток, способный к слиянию с клетками костного мозга, - нейроны Пуркинье [7]. То, что двухъядерные нейроны в мозжечке образуются именно путем слияния, было доказано экспериментами с пересадкой костного мозга мышей от GPF-позитивных доноров к GFP-негативным реципиентам противоположного пола (GPF-зеленый флуоресцентный белок) [103]. Со временем гибридные клетки прекращали экспрессию белков CD11b и CD45, характерных для клеток костномозгового происхождения, и начинали экспрессировать зеленый флуо-ресцентый белок GFP, который находился под контролем промотора L7-pcp-2, специфичного для клеток Пуркинье. Эти наблюдения указывают на то, что в донорском ядре началась экспрессия нейрональных генов [103]. Количество слияний клеток костномозгового происхождения с клетками других тканей значительно увеличивается если в этих тканях протекает воспалительный процесс, и снижается под воздействием противовоспалительных препаратов (преднизолон) [11, 104], что указывает связь этого феномена с воспалением. Однако, имеющихся данных явно недостаточно, чтобы можно было сделать фундаментальные выводы. Данное явление требует дальнейшего тщательного изучения. Суммарные данные о белках, задействованных на различных этапах клеточного слияния, представлены в таблице 2. конфликт интересов Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов. Благодарности Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 17-75-30066). таблица 2. Белки, задействованные на различных этапах слияния клеток Событие Коммитирование Миграция Адгезия Слияние Оплодотворение Формирование трофобласта Слияние миобластов Слияние макрофагов EGF/EGFR LIF GM-CSF Активин А ХГЧ IL-4 IL-13 RANK TLR-2 TREM-2 DAP-12 M-CSF CD44 CCL2 DC-STAMP IL-4 Маннозный рецептор CD164 Простациклин CCL2 DC-STAMP IZUMO1, Juno TSSK6 CD9 CD81 Е-кадгерин Кадгерин-11 ZO-1 Эзрин Коннексин-43 Нефрин Интегрины Киндлин Е-кадгерин Неогенин Нефронектин Е-кадгерин Интегрины CD36 Коннексин-43 MMP9 Тетраспанины Синцитин1 ASCT2 синцитин-1 ASCT2, синцитин-2 MFSD2a Синцитины (мужчины) Myomaker? Myomerger? P2X7