Expression pattern and alternative splicing of HTT gene in human tissues

Full Text

Введение Несмотря на то, что ген HTT открыт уже много лет назад, его функции до конца не ясны. Мутация в этом гене является причиной развития болезни Хантингтона (БХ) [1, 2]. Экспансия тринуклеотидных повторов CAG в первом экзоне гена НТТ приводит к синтезу мутантного белка mHTT с удлиненным полиглутаминовым трактом, который имеет склонность к агрегации внутри клетки [3]. Однако конкретные механизмы развития заболевания до сих пор остаются неизученными. В частности, не известны причины избирательной гибели нейронов стриатума на ранних стадиях развития болезни, хотя ген НТТ (как мутантный, так и нормальный) экспрессируется в большинстве органов и тканей организма [2]. e-mail: amal@bionet.nsc.ru Описано много клеточных процессов, в которых принимает участие НТТ, таких как внутриклеточный везикулярный транспорт, цилиогенез, участие в процессах деления клеток, аутофагии и регуляция транскрипции генов [4, 5]. Такое разнообразие функций можно объяснить структурной ролью белка НТТ, т.е. его способностью связываться с другими белками, объединяя их в комплексы. Этому способствует пространственная структура НТТ, состоящая из альфа-спиралей (HEAT-повторов), склонных к белок-белковому взаимодействию [6]. Ранее проводились исследования экспрессии НТТ в различных отделах мозга человека, и был обнаружен альтернативный сплайсинг транскриптов [7-10]. Попытки найти зависимость между наличием альтернативных Гены & Клетки Том XII, № 4, 2017 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 27 форм НТТ и развитием БХ не привели к успеху [7]. Разницы в уровне экспрессии НТТ в тканях людей с БХ и здоровых людей также не было обнаружено [1]. Исследователи сходятся на том, что доля альтернативно сплайсированных форм НТТ невелика по сравнению с нормальным полноразмерным транскриптом. Однако было выдвинуто предположение, что доля отдельных вариантов НТТ может повышаться на разных стадиях развития организма, и, возможно, имеет некоторое функциональное значение [7-10]. Цель настоящей работы заключалась в изучении частоты встречаемости различных альтернативных вариантов транскрипта HTT в разных органах и тканях (как здоровых людей, так и больных БХ) и оценке возможной роли альтернативного сплайсинга в синтезе изоформ белка НТТ с различающимися функциями. Материал и методы Последовательности генов HTT, PCP2 и SPTBN2 были экстрагированы из базы данных GenBank. Последовательность локуса с геном HTT была экстрагирована из геномной последовательности NC_018915.2 (Homo sapiens chromosome 4, alternate assembly CHM1_1.1, whole genome shotgun sequence). На всех иллюстрациях данной работы нуклеотидная позиция 1 соответствует позиции 3043294 геномной последовательности NC_018915.2. Данные для анализа транскрипто-мов клеток, тканей и органов человека были загружены из базы данных NCBI SRA (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/sra). Всего проанализировано 72 образца, из них 7 - от больных БХ (табл. 1). Для детекции повторов использовали программу RepeatMasker [11]. Транскриптомы картировали на соответствующие референсные последовательности с использованием программы HISAT2 [12] и STAR [13]. Результирующие файлы в формате SAM визуализировали и проводили первичный анализ с использованием программного обеспечения Geneious 9.0.2 [14]. Экспрессию генов в целом и по экзонам определяли программой STRINGTIE [15]. Альтернативный сплайсинг исследовали программой RMATS [16] и визуализировали с использованием программы SashimiPlot. Результаты С целью изучения транскрипции одного из ключевых генов в БХ был выполнен анализ профилей экспрессии локуса гена HTT человека в разных тканях. Мы использовали данные по секвенированию транскриптомов 72 образцов (табл. 1). Общая схема анализа приведена на рис. 1. Данные RNA-seq загружали из базы данных SRA NCBI. Из GeneBank экстрагировали последовательности исследуемых генов и картировали на них риды из различных SRA экспериментов, используя программы HISAT2 и STAR. Пример профиля экспрессии в тканях кортек-са, стриатума и клетках Пуркинье показан на рис. 2. Как видно на рисунке, в большинстве образцов риды полностью покрывают весь ген. Пики приходятся на экзоны и некоторые мобильные элементы, в основном это молодые Alu и LINE. Более детально профиль экспрессии анализировали программой STRINGTIE. Мы не наблюдали какой-либо значимой экспрессии на ранних стадиях развития эмбриона (морула, бластоциста) и, что любопытно, в клетках Пуркинье экспрессия либо отсутствует полностью, либо наблюдается незначительное покрытие отдельных экзонов. Таблица 1. Список исследованных образцов из базы данных SRA Орган/ткань Образцы Сердце Печень Костный мозг Моноциты крови Эндотелий сосудов Яичник Семенник Клетки раннего эмбриона Эмбриональные стволовые клетки Плацента Кора больших полушарий Полосатое тело (стриатум) Клетки Пуркинье Мозжечок SRR3192434, SRR4421689 SRR4421735, SRR4421736, SRR5171068, SRR5171069 SRR5048183, SRR5048184 Здоровый человек: ERR1665675, ERR1665677, ERR1665684, ERR1665685 Больной БХ: ERR1590047, ERR1590048, ERR1590049, ERR1590052 SRR3192368, SRR3192369 SRR4422625, SRR5171072 SRR4422588, SRR4421668 SRR445718, SRR445729, SRR490965, SRR490988, SRR491004, SRR491017 ERR1273707, ERR1273713, SRR3192149, ERR1243461, ERR1837048, SRR529646, SRR529647 ENCFF000GM_1, ENCFF000GM_2, ENCFF000GF_1, ENCFF000GF_2 Здоровый человек: SRR1222587, SRR1222589, SRR1222592, SRR1222599, SRR1747160, SRR1747151, SRR1747191, SRR3191744, SRR3191745, SRR1222678, SRR1222680 Больной БХ: SRR1747206, SRR1747209, SRR1747205 SRR3393492, SRR3393493, SRR3393494, SRR3393495, SRR3393504, SRR3393506, SRR3393510, SRR3393511, SRR3393521, SRR3393522 ENCFF002BIR, ENCFF002BJA, ENCFF002BJL, ENCFF002BJS, SRR3192296, SRR3192265, SRR3191839, SRR3191813 SRR1222586 Гены & Клетки Том XII, № 4, 2017 28 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Уровень экспрессии гена HTT в разных тканях значительно варьирует (рис. 3). Стабильно высокие значения наблюдаются в стриатуме, которые в 3-4 раза превышают значения для других отделов головного мозга. Неожиданно высокий уровень экспрессии обнаружен в семенниках, в ЭСК и клетках раннего эмбриона до 4-х клеточной стадии. В то же время, экспрессия НТТ очень сильно снижена в мо-руле и бластоцисте. Интересным фактом является низкий уровень экспрессии HTT в клетках Пуркинье. Достоверность полученных результатов подтверждается высоким уровнем экспрессии специфичных для этого типа клеток генов PCP2 и SPTBN2 (рис. 4). В ряде работ было показано наличие альтернативного сплайсинга HTT в тканях мозга человека и мыши [7-10]. Мы исследовали альтернативный сплайсинг программой RMATS. В результате анализа образцов выявлено более 30 вариантов альтернативного сплайсинга, 21 из которых представлены Рис. 1. Общая схема анализа данных в более чем 5% транскриптов (табл. 2). 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 180,000 200,000 215,257 20,000 40,000 100.000 120.000 140,000 160,000 Б 111 іііі Ні і ki Ln і Jiiil jiLLiIlli kmJi Li < її* і h iiutiL.1 ILiJi ні nil jlllftii I, iiiltL.i iii і J hi.. і і ill > 1.1 <t і I 20,000 40,000 60,000 80,000 120,000 140,000 160,000 180.000 200,000 215,211 В JiUiilUlijiiLiiilLt.l ...bJ-i-liJl. Jl..I..AI,Li .an, ■■l.Lilii.limi.lJiilll.LII .L.I.Ü А ,L IDLlII U..Jk.l,....,LL.jJ.J.ll.UUJ.L.lLi..ll„4jlLllM. ..j ..,j| I I <-Ы < йуждиуишшау! &цк|ищк| цущ щш шш іШМк А LJiJ UAAUttk ІШä і ШИЙНШІІ Sr J ШІ Ш і ил шммамц ilui u| |L u ujj [і щш it j j U і ШЇ ШІ WwrlvMVVMIPM flrPIfi rv ИЯІЯт iMMWVlR IWrf ЯЯпл ШІп г V III' nwTWW rü 1 RMNthK S. '••*! mit ir і l ИІчНІИИЯ" ігпг nl Ir rr "Mi rr ™™ н И I R * rTl І Ш1І [-(-(-H-)-1'-П-hH-1 W-h-m.hr .. і Г--М h-И )-1-h-m-1> и и hhi mu-и-»-nun »i-> \ i>nt» мни »пи» h-н im шаіаішаи Г Рис. 2. Профиль экспрессии гена HTT в тканях человека. Зелеными линиями условно обозначены гены, красными - известные транскрипты, оранжевым цветом изображены мобильные элементы, черные прямоугольники - риды. Уровень экспрессии показан голубым цветом, его значение определялось как десятичный логарифм числа ридов, картированных на референсную последовательность. Черными звездочками обозначены «горячие точки» событий сплайсинга. Буквами обозначены профили: А - кора больших полушарий; Б - клетки Пуркинье; В - стриатум; Г - детальный пример картирования ридов на генный локус HTT Гены & Клетки Том XII, № 4, 2017 оригинальные исследования 29 Рис. 3. Уровень экспрессии гена НТТ в разных тканях А А. м -ill 11* • ..Li,і. iJh am., rft.iÜU mil I^Hli Д1.887 *3,|87 4S.8S7 A7.886 49,883 SI,892 S3.?71 56.220 1S.B98 17.&9? 19,897 21.897 23.897 25.897 27.897 29,897 31.897 33.8« 15.894 37,891 4-1 -и-IH- -H-ih->- JH3>- -H+- -Н-Н-» ► »НШ-І-4 -h-h-»-►-нч-нж-ыашп» Б Рис. 4. Профили экспрессии генов SPTBN2 (А) и PCP2 (Б) в клетках Пуркинье (SRR3192265). Зелеными линиями условно обозначены гены, красными - известные транскрипты, оранжевым цветом изображены мобильные элементы. Уровень экспрессии показан голубым цветом, его значение определялось как десятичный логарифм числа ридов, картированных на референсную последовательность Таблица 2. Список обнаруженных альтернативных вариантов сплайсинга гена НТТ, доля которых составляет более 5% от общего числа транскриптов Событие сплайсинга Образец Ссылка на исследование Рамка считывания Отсутствие экзона 3 ЭСК, костный мозг, мозжечок, кора Настоящее исследование; Сдвигается, больших полушарий [9] стоп-кодон Дополнительный экзон Костный мозг, эндотелий, семенники, Настоящее исследование Сдвигается, 3b яичники, плацента стоп-кодон Дополнительный экзон Сердце, костный мозг Настоящее исследование Сохранена, 3b стоп-кодон Отсутствие экзона 4 Эндотелий, кора больших полушарий, мозжечок Настоящее исследование; [9] Сохранена Отсутствие экзона 10 Эндотелий, ЭСК Настоящее исследование; [7, 8] Сохранена Укорочение экзона 12 ЭСК, семенники, плацента, кора больших полушарий Настоящее исследование Сдвигается, стоп-кодон Отсутствие экзона 13 Плацента, кора больших полушарий Настоящее исследование; [10] Сдвигается Укорочениеэкзона 13 ЭСК, сердце, костный мозг, Настоящее исследование; Сохранена на 48 нуклеотидов моноциты,яичник, плацента, кора больших полушарий, мозжечок [9, 10] Отсутствие экзона 22 ЭСК, яичник, эндотелий, кора больших полушарий Настоящее исследование; [9] Сохранена Гены & клетки Том XII, № 4, 2017 30 оригинальные исследования окончание таблицы 2 Событие сплайсинга Образец Ссылка на исследование Рамка считывания Отсутствие экзона 27 Плацента, мозжечок Настоящее исследование; [7, 9] Сдвигается, стоп-кодон Удлинение экзона 36 на 108 нуклеотидов Мозжечок Настоящее исследование Сохранена, стоп-кодон Отсутствие экзона 38 Моноциты Настоящее исследование; [9] Сохранена Отсутствие экзона 41 Костный мозг, плацента, Настоящее исследование; Сдвигается, кора больших полушарий [9, 10] стоп-кодон Дополнительный экзон ЭСК, сердце, печень, моноциты, Настоящее исследование; Сохранена, 41b эндотелий, семенник, яичник, плацента, кора больших полушарий, мозжечок [8-10] +30 а.о. Удлинение экзона 47 на 20 нуклеотидов Костный мозг, мозжечок Настоящее исследование Сдвигается, стоп-кодон Отсутствие экзона 50 ЭСК Настоящее исследование Сдвигается, стоп-кодон Удлинение экзона 50 на 21 нуклеотид Моноциты, кора больших полушарий Настоящее исследование; [10] Сохранена Укорочение экзона 59 на 9-12 нуклеотидов Кора больших полушарий Настоящее исследование Сохранена Полужирный шрифт - варианты сплайсинга транскрипта НТТ, которые не были описаны ранее. Большинство из обнаруженных нами вариантов сплайсинга было описано ранее [7-10]. Наиболее частым вариантом сплайсинга является наличие дополнительного экзона 41b, который появляется в 6-56% транскриптов НТТ в разных тканях организма. Данный вариант сплайсинга не приводит к сдвигу рамки считывания и добавляет 30 аминокислотных остатков (а.о.) в структуру белка. Найден ряд новых вариантов, не описанных ранее, таких как дополнительный экзон 3b, укорочение экзона 12, альтернативные границы экзонов 36 и 47 (в табл. 2 выделены жирным шрифтом; рис. 5). Экзон 3b встречается в 3-12% транскриптов. Однако данный вариант сплайсинга, а также варианты с укороченным экзо-ном 12 и удлиненным экзоном 47, приводят к сдвигу рамки считывания и появлению преждевременного терминирующего кодона, и таким образом являются аберрантной формой транскрипта. При удлинении экзона 36 на 108 нуклеотидов рамка считывания сохраняется, но также появляется стоп-кодон. Наибольшее количество аберрантных форм сплайсинга наблюдается в плаценте, эндотелии и клетках крови. В стриатуме не было обнаружено альтернативного сплайсинга НТТ, в то время как остальные отделы головного мозга демонстрируют наличие альтернативных и аберрантных форм (табл. 2). А 6000 г 4500 -3000 1500 ■С. NA 2-1 IncLevel: 0.05 18.0 4-N ГірІ Б 10000 7500 5000 2500 NA 2-1 IncLevel: 0.95 I >>)>>))>>)>>))>>))>))>>))> )■ I )>>))>>)>>))>>))>))>>))> І ))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))■ В 3000 В 2250 1500 750 NA 2-1 IncLevel: 0.09 I" 4500 137011 137146 137395 138070 138750 138966 166331 166513 167263 168013 168507 ))))))))}))))))})))))))■ I)))))))))))))))))))))))))) И))))))))))))))))))))))))))))) )| ))))))))))))))))))))))))))) Рис. 5. Варианты сплайсинга отдельных экзонов гена НТТ: А - дополнительный экзон 3b; Б - укороченный экзон 12; В - удлиненный экзон 36; Г - удлиненный экзон 47 Гены & клетки Том XII, № 4, 2017 оригинальные исследования 31 Ранее A.C. Hughes с коллегами (2014) не выявили связи между наличием альтернативного сплайсинга гена НТТ и БХ [7]. В частности, не было найдено значимых различий в частоте встречаемости транс-криптов с делецией экзонов 28 и 29 у здоровых людей и больных БХ. В нашем исследовании было проанализировано 4 образца мононуклеарных клеток крови и 3 образца префронтальной коры головного мозга (района BA9) от пациентов с БХ. Значимых отличий в частоте встречаемости и разнообразии альтернативных вариантов транскриптов НТТв образцах больных людей по сравнению с контрольной группой также не было выявлено. Обсуждение Развитие БХ у пациентов начинается в возрасте 35-40 лет с гибели нейронов стриатума, позднее нейродегенеративные процессы распространяются на другие отделы мозга, в частности на кору больших полушарий, гиппокамп, мозжечок [17]. Причиной развития заболевания является мутация в первом экзоне гена НТТ, приводящая к синтезу белка с удлиненным полиглутаминовым трактом. Синтез мутантного белка НТТ у больных БХ ведет к накоплению белковых агрегатов в клетках, активирует протеолиз НТТ и вызывает накопление укороченных фрагментов этого белка, а также нарушает процессы аутофагии и митофагии [18, 19]. Преимущественная гибель нейронов стриатума на первых стадиях развития болезни, вероятно, обусловлена особенностями экспрессии НТТ в данном типе клеток. Мы проанализировали транскриптомы 72 образцов тканей человека и выявили некоторые различия в паттерне экспрессии НТТ в стриатуме и других тканях и отделах мозга. Уровень экспрессии гена HTT неоднороден в разных тканях, отделах и клетках мозга (рис. 3). В клетках стриатума экспрессия HTT наиболее высока. Неожиданным результатом явилось отсутствие транскрипции НТТ в клетках Пуркинье, в то время как в ткани мозжечка в целом этот ген экспрессируется. Согласно ранее полученным данным, у больных БХ клетки Пуркинье подвержены нейродегенеративным процессам наряду со средними и малыми нейронами [20]. Кроме того, были показаны значительные изменения в области мозжечка при развитии ней-родегенеративных процессов у пациентов с БХ [21]. По всей видимости, наличие мутантного белка НТТ не являлось первопричиной нейродегенерации в мозжечке, и патологические процессы были обусловлены другими факторами, например, воспалительными процессами в мозге [22]. Изменение в первичной структуре белка НТТ, вызванное альтернативным сплайсингом транскриптов, может повлиять на его пространственную конформацию. 3D структура белка HTT состоит из альфа-спиралей (НЕАТ-повторы), разделенных неструктурированными спейсерами [6]. Такое строение позволяет белку служить каркасом для формирования белковых комплексов. Изменение конформации НТТ в результате добавления или укорочения полипептидной цепочки может привести к изменению его функции. Мы проанализировали данные по наиболее часто встречающимся вариантам альтернативного сплайсинга транскриптов НТТ и выявили наличие «горячих точек», которые приходятся на районы 3-6, 10-13, 27-29 и 41-42 экзонов (рис. 2). Первый и второй районы лежат на границах HEAT доменов HTT, отвечающих за белок-белковые взаимодействия. Третий район затрагивает один из сигналов ядерной локализации NLS [23]. Четвертый район расположен в слабоструктурированной зоне белка между двумя HEAT-доменами, однако содержит несколько сайтов фосфорилирования [24]. Очевидно, что изменения в первичной структуре всех перечисленных районов белка НТТ могут привести к изменению вторичной конформации белка и/или его функций. Большинство из обнаруженных нами вариантов сплайсинга приводят к сдвигу рамки считывания и появлению терминирующего кодона. Такие формы транскриптов следует причислять к аберрантным формам сплайсинга. Можно заключить, что единственным вариантом альтернативного сплайсинга НТТ является дополнительный экзон 41b. В этом случае рамка считывания сохраняется и в структуру белка добавляется последовательность из 30 аминокислотных остатков, которая содержит 2 потенциальных сайта фосфорилирования [9]. Данный вариант встречается практически во всех органах и тканях человека и представлен 6-56% транскрип-тов. Обнаружены и другие варианты альтернативного сплайсинга, не приводящие к сдвигу рамки считывания, но они представлены гораздо меньшей долей транскриптов (табл. 2). Обнаруженный нами вариант сплайсинга НТТ, который содержит дополнительный экзон 3b, приводит к сдвигу рамки считывания и преждевременной остановке трансляции, в результате чего синтезируется укороченный фрагмент белка НТТ. Известно, что укороченные фрагменты НТТ, полученные в результате его протеолиза, являются токсичными для клетки, так как С-концевые участки этого белка могут нарушать регуляцию процесса аутофагии и вести к клеточной гибели [18]. Также показано, что N-концевые фрагменты белка НТТ, образовавшиеся в результате неполного сплайсинга, вызывают гибель клеток [25]. Следует отметить, что вариант транскрипта, содержащий экзон 3b, встречается в эндотелии, яичниках, костном мозге, но не был обнаружен в тканях мозга. В клетках стриатума практически не выявляются альтернативные транскрипты. Вероятно, это связано с тем, что нормальное функционирование белка HTT в клетках стриатума очень важно для их жизнедеятельности, либо данный тип клеток наиболее чувствителен к накоплению укороченных фрагментов НТТ. Наибольшее количество альтернативно сплай-сированных транскриптов наблюдается в плаценте, эндотелии и клетках крови. По-видимому, это связано с непродолжительным сроком жизни этих клеток. Плацента является временным органом, питающим плод. Эндотелий также состоит из активно пролиферирующих короткоживущих клеток [26]. Вполне вероятно, что накопленные аберрантные фрагменты НТТ не успевают нанести большой вред жизнедеятельности данных клеток, поскольку даже процессы нейродегенерации в мозге больных БХ начинаются лишь в возрасте после 35 лет. Таким образом, патологический эффект от мутантного белка НТТ и его фрагментов является кумулятивным. В тканях, в которых частота событий неканонического сплайсинга высока, белок HTT, по-видимому, не является строго обязательным, и его функции дублируются другими молекулярными мехнизмами. В стриатуме, предположительно, существует меха Гены & клетки Том XII, № 4, 2017 32 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ низм «контроля качества» транскриптов НТТ. Белок НТТ играет важную роль в функционировании данного типа клеток, а процессы, в которых он задействован, не имеют дублирующих механизмов и являются облигатными для жизнедеятельности нейронов стриатума. Заключение В результате анализа паттерна транскрипции гена НТТ в разных тканях человека обнаружено, что неканонические варианты сплайсинга составляют лишь очень небольшую долю транскриптов НТТ, часто приводят к сдвигам рамки считывания и появлению преждевременного стоп-кодона. Исключение составляет лишь вариант, несущий дополнительный экзон 41b, добавляющий 30 а.о. в полипептидную цепь, а также несколько вариантов транскриптов с альтернативными границами экзонов, не изменяющими рамку считывания белка. Все остальные варианты сплайсинга следует отнести к аберрантным формам транскрипта НТТ. Отсутствие аберрантных форм сплайсинга в клетках стриатума служит дополнительным доказательством важности нормального функционирования белка НТТ в данном типе нейронов.

About the authors

A. A Malakhova

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the RAS; Novosibirsk National Research State University

Email: amal@bionet.nsc.ru

E. A Elisaphenko

Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the RAS; E.N. Meshalkin National Medical Research Center; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the RAS; Institute of Molecular and Cellular Biology, Siberian Branch of the RAS

References

Supplementary files