Cytotoxic activity of T-2 toxin for a immortalized of cattle fetal lung epithelium cells

Full Text

Введение Среди фузариотоксинов, относящихся к токсинам микроскопических грибов, Т-2 токсин обладает наиболее сильным патогенным действием [1, 2]. Поступление его в организм возможно различными путями, он легко проникает во все типы клеток, оказывает влияние на многие органы и системы, приводя к развитию общих и местных патологических реакций. Воздействие на молекулярном уровне осуществляется через ингибирование синтеза протеинов, нуклеиновых кислот, транспортной системы митохондрий, синтеза митохондриальных белков [3-5], повреждение хроматина [6], инициирование окислительных процессов, запуск апоптоза в клетках e-mail: idiyatov_ilgiz@mail.ru различных тканей [7-11]. По данным ряда авторов при пероральном [1, 12-14] или ингаляционном [15] поступлении в организм Т-2 токсина, наряду с развитием системных эффектов, отмечаются и локальные изменения в дыхательной системе. Эпителий дыхательных путей является барьером для макромолекул и инфекционных агентов и его повреждение в зависимости от степени выраженности может стать причиной развития как инфекционных заболеваний, так и острых жизнеугрожающих состояний. Таким образом, проведение исследований по выявлению характера воздействия Т-2 токсина на клетки дыхательной системы актуально. В литературе описаны эффекты Т-2 токсина на фибробласты легких V79 [7], альвеолярные макрофаги (PAM) [16], однако данных по влиянию Т-2 токсина на клетки эпителия нами не обнаружены. Цель работы - изучение токсического действия Т-2 токсина на перевиваемые клетки эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (ЛЭК). материал и методы Клеточная культура Работа выполнена на культуре ЛЭК, предоставленной Специализированной коллекцией перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (ВИЭВ, Россия). Клетки культивировали в питательной среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco, США), 0,5% цэфтриаксона (Синтез, Россия) и 0,5% L-глутамина (Gibco, США) в СО2-инкубаторе MCO-19AIC (Sanyo, Япония) при 5% СО2, 95% влажности, температуре 37°С. 2 Для экспериментальной контаминации клеток использовали кристаллический Т-2 токсин, синтезированный в лаборатории микотоксинов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» А.И. Сергейчевым, который растворяли в этиловом спирте. Идентификация Т-2 токсина Идентификацию Т-2 токсина проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) в системе высокого разрешения HPLC-Dionex UltiMate 3000 RSLC MS/ MS Bruker ESI-(Qq) TOF maxis II System (Bruker, Германия). Хроматографическое разделение осуществляли на обратно-фазной колонке ACClaim RSLC 120 C18, 2,2 pm, 120 A°, 2,1x100 mm с предколонкой VanGuard (Thermo scientific, Германия): Acquity UPLC BEN C18 1,7 pm, 2,1x5,0 mm. Фракции элюировали буферными растворами: раствор А - метанол/вода (10:90) с 5 мМ формиата аммония и 0,01% муравьиной кислоты; раствор В - метанол с 5 мМ формиата аммония. Параметры МС анализа: ионный источник - электроспрей по положительным ионам; напряжение на капилляре 4500 v. Сканирование спектров проводили в двух режимах: МС и МС/МС (bbcid) в диапазоне масс 30-1000 m/z. Результаты исследования приведены на рис. 1. Оценка токсического эффекта Т-2 токсина на культуру клеток ЛЭК Клеточную суспензию в концентрации 2,5x105 кл/ мл питательной среды (ПС) разливали по 200 мкл в лунки стерильного 96-луночного культурального планшета (Eppendorf AG, Германия). Т-2 токсин, растворенный в 96% этиловом спирте, вносили в количестве 6 мкл в дозах 6000; 3000; 2000; 1000; 500; 250; 100; 50 и 25 нг/мл. В качестве контрольных групп служили интактные клетки, культивированные в ПС (контроль 1), а также клетки, инкубированные в среде 6 мкл 96% этилового спирта без токсина (контроль 2). Количество повторов в каждой группе - 8. Клетки выдерживали в СО2-инкубаторе (5% СО2, 95% влажности, 37°С) в течение 20 ч. Оценка морфологии клеток Морфологию клеточных культур оценивали под инвертированным микроскопом Nikon Eclipse TS 100 (Япония), использовали камеру DCM 500 и программное обеспечение Scope Photo 3.0. Клеточный монослой охарактеризовывали по покрытию поверхности лунки, форме клеток, наличию погибших клеток и клеточных агрегатов. Оценка цитотоксичности Клетки диспергировали смесью растворов версе-на (0,02%) и трипсина (0,025%) (ПанЭко, Россия) в соотношении 1:9 и выдерживали в термостате 10-15 мин. при 37°С. Для прекращения действия трипсина и версена клетки осаждали центрифугированием в течение 2 мин. при 1500 об/мин., надосадочную жидкость сливали, осадок перемешивали с 200 мкл питательной среды. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева, для определения их жизнеспособности к клеточной суспензии добавляли 200 мкл 0,5% водного раствора трипанового синего (живые клетки оставались бесцветными, мертвые окрашивались в синий цвет). Воздействие токсина на клетки определяли по следующим параметрам: коэффициенту жизнеспособности - отношение количества живых клеток к общему количеству клеток, %; индексу пролиферации - отношение количества «выросших» клеток к исходному количеству; митотическому индексу - отношение количества митотически делящихся клеток к общему количеству клеток, %о [17]; индексу цитотоксичности по Л.П. Дьяконову - отношение количества исходных клеток к числу живых клеток к концу эксперимента [17]; цитотоксическому индексу по М.В. Тертичной - отношение количества живых клеток в тестовой группе к числу живых клеток в контроле [18, 19]; цитотоксическому индексу по Г.П. Червонской - отношение разницы между долями погибших клеток в контроле и тестовой группе к доле погибших клеток в контроле [20]. Статистический анализ Статистическую обработку результатов осуществляли методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стьюденту и программы Microsoft Excel. результаты и обсуждение Оценка морфологических параметров клеток является важным критерием при исследовании воздействия на клеточные популяции различных веществ. При культивировании клеток в среде, содержащей токсин в дозах 6000, 3000, 2000, 1000 и 500 нг/мл (рис. 2 и 3) большинство клеток имели измененную форму по сравнению с контролем, клетки конденсировались, уменьшались в размерах, были обособлены, монослой отсутствовал, наблюдалась фрагментация клеток, большое количество неоформленных клеточных агрегатов, дебриса и апоптозных тел. Такая морфологическая картина свидетельствует о подавлении процесса деления и высоком уровне клеточной гибели. При снижении концентрации токсина до 100 нг/мл клеточных агрегатов и дебриса становилось меньше, а клетки начинали образовывать монослой (рис. 4). Рис. 1. Результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии Т-2 токсина Рис. 2. Клетки линии ЛЭК при культивировании в течение 20 ч. в среде DMEM, содержащей Т-2 токсин в дозе 6000 нг/мл: К - специфическое сжатие клетки и конденсация хроматина; Ф - фрагментация ядра; А - фрагментация клетки на ряд апоптотических телец; Д - дебрис. Ув. х400 Рис. 3. Клетки линии ЛЭК при культивировании в течение 20 ч. в среде DMEM, содержащей Т-2 токсин в дозе 1000 нг/мл: К - специфическое сжатие клетки и конденсация хроматина; Ф - фрагментация ядра; А - фрагментация клетки на ряд апоптотических телец; Д - дебрис. Ув. х400 Рис. 4. Клетки линии ЛЭК при культивировании в течение 20 ч. в среде DMEM, содержащей Т-2 токсин в дозе 100 нг/мл: КА - клеточные агрегаты; Фпк - фибробластоподобные клетки; М - митотически делящаяся клетка; К - специфическое сжатие клетки и конденсация хроматина; Ф - фрагментация ядра; А - фрагментация клетки на ряд апоптотических телец; Д - дебрис. Ув. х400 Рис. 5. Клетки линии ЛЭК при культивировании в течение 20 ч. в среде DMEM, содержащей Т-2 токсин в дозе 25 нг/мл: ЦПМ - цитоплазматическая мембрана; В - вакуолизация цитоплазматической мембраны; ЦП - цитоплазма; Я - ядро; ЯР - ядрышко; М - митотически делящаяся клетка. Ув. х400 При концентрации токсина 50 нг/мл, несмотря на наличие участков со слабыми клеточными контактами, монослой был достаточно хорошо выражен, а форма клеток была эпителиоподобной, большинство клеток имело выраженную цитоплазматическую мембрану и ядро. В лунках, содержащих Т-2 токсин в дозе 25 нг/мл (рис. 5), так же, как в контрольных лунках, клетки образовывали полный монослой, имели четко очерченную мембраной цитоплазму, ядро с ядрышками, вакуолизацию плазмолеммы. Таким образом, Т-2 токсин в дозах от 50 до 6000 нг/мл оказывал дозозависимое цитотоксическое действие на клетки эпителия легкого. Т-2 токсин в дозе 25 нг/мл не оказывал негативного влияния на клетки ЛЭК. Гибель клеток под воздействием Т-2 токсина посредством апоптоза не зависит от происхождения и специализации клеток, что доказывают результаты исследований ряда авторов на человеческих клетках нейробластомы (КМС-32) [21], эмбриональных стволовых клетках D3 и фибробластах 3Т3 [22], клетках карциномы толстой кишки человека и эпителиоцитах проксимальных почечных канальцев [23], репродуктивных клетках Лейдига ТМ-3 [10], тимо-цитах [24], хондроцитах [8]. Важным проявлением жизнеспособности клеток является их пролиферация, выражающаяся в увеличении количества клеток в культуре [25]. Культивирование клеток эпителиоцитов в среде с Т-2 токсином в дозах от 50 до 6000 нг/мл приводило к снижению их абсолютного количества, которое составляло от 8,33 до 43,53%, уменьшение количества при дозе 25 нг/мл было незначительным (2,35%) и сопоставимо с контролем 2 (1,36%). Снижение количества клеток в контроле 2 могло быть связано с действием растворителя - этилового спирта. Для оценки степени воздействия Т-2 токсина на ЛЭК были рассчитаны коэффициент жизнеспособности (табл. 1), индекс пролиферации, митотический индекс и индекс цитотоксичности (табл. 2) таблица 1. Жизнеспособность клеток линии лЭК при культивировании в присутствии Т-2 токсина в течение 20 ч. Группа Доза Т-2 токсина, нг/мл Количество живых клеток Количество погибших клеток Коэффициент жизнеспособности ПС (контроль 1) - 600,00±17,68 108,33±10,21 85,24±1,22 ПС+С2Н5ОН (контроль 2) - 590,33±10,21 108,33±10,21 84,58±1,41 ПС+С2Н5ОН +Т-2 токсин 6000 100,00±17,68* 300,00±17,68* 25,00±4,42* 3000 183,33±10,21* 241,67±10,21* 43,12±1,21* 2000 250,00±17,68* 250,00±17,68* 50,00±3,54* 1000 291,67±10,21* 266,67±10,21* 52,24±1,61* 500 325,00±0,00* 233,33±10,21* 58,23±1,05* 100 375,00±17,68* 208,33±10,21* 64,27±1,52* 50 458,33±10,21* 191,67±10,21* 70,51±1,57* 25 583,33±10,21 108,33±10,21 84,35±1,36 * - различия с контролем статистически значимы при p<0,05. таблица 2. Пролиферативная активность клеток линии лЭК и цитотоксичность для них Т-2 токсина при культивировании в течение 20 ч. s s Доза Т-2 Группа токсина, нг/мл >s s о ° ш s o' II s ■ g L-к т s о S £ Se >5 * о 0) T s о I o I s co R (B О T * 5 $ & - ,<u s I- *-*' 8 = S GQ О О O g S III ПС (контроль 1) - 1,83±0,11 6,46±0,13 -0,05±0,09 1,02±0,03 0,42±0,01 ПС+С2Н5ОН (контроль 2) - 1,80±0,07 6,42±0,11 -0,07±0,09 0,99±0,02 0,43±0,00 ПС+С2Н5ОН+Т-2 токсин 6000 0,60±0,00* 3,75±0,00* -4,25±0,31* 0,17±0,03* 2,61±0,48* 3000 0,70±0,07* 4,10±0,25* -2,98±0,09* 0,30±0,02* 1,37±0,07* 2000 1,00±0,00* 5,00±0,00* -2,50±0,25* 0,42±0,03* 1,01±0,07* 1000 1,23±0,04* 5,52±0,08* -2,34±0,11* 0,49±0,02* 0,86±0,03* 500 1,23±0,04* 5,52±0,08* -1,92±0,07* 0,54±0,00* 0,77±0,00* 100 1,33±0,08* 5,71±0,15* -1,50±0,11* 0,63±0,03* 0,67±0,03* 50 1,60±0,00 6,15±0,00 -1,06±0,11* 0,76±0,02* 0,55±0,01* 25 1,77±0,04 6,38±0,05 -0,10±0,09 0,97±0,02 0,43±0,00 - различия с контролем статистически значимы при p<0,05. Как видно из таблиц 1 и 2 коэффициент жизнеспособности, индекс пролиферации и митотический индекс клеточной линии ЛЭК зависели от дозы Т-2 токсина. Если при дозе Т-2 токсина 25 нг/мл эти показатели не отличались от контроля, то с возрастанием дозы токсина они снижались. Полученные нами данные согласуются с результатами других исследований, где в экспериментах на первичной культуре эндотелиальных клеток капилляров мозга свиньи (PBCEC) [26], клетках кишечника человека Caco-2 [27], первичной культуре клеток печени [28] было показано, что жизнеспособность клеток снижается в присутствии Т-токсина и это снижение зависит от дозы токсина. Кроме того, ряд авторов также доказали, что ингибирование пролиферации клеток Т-2 токсином также зависит от дозы препарата [29, 30]. Индексы цитотоксичности Т-2 токсина для клеток линии ЛЭК, рассчитанные тремя разными методами, выявили общую тенденцию повышения цитотоксичности исследуемого вещества с увеличением его дозы (табл. 2). Вычисление показателей цитотоксичности необходимо для определения максимально переносимой, средне летальной (IC50) и летальной доз (1С100) тестируемого вещества для культур клеток [19]. По результатам проведенного анализа концентрацию Т-2 токсина 25 нг/мл в культуральной среде можно принять за дозу, не оказывающую цитотоксического действия на эпителиальные клетки легкого, и считать максимально переносимой (МПД). При концентрации токсина 1000 нг/мл индекс цитотоксичности составил 0,50, эта доза наиболее близка к IC50. Определить летальную дозу в нашей работе не представлялось возможным, так как индекс цитотоксичности в максимальной исследуемой дозе не приближался к 0. Установленная нами зависимость цитотоксичности Т-токсина от дозы препарата подтверждает данные, полученные на клеточных культурах фибробластов десны [31], первичной культуре эпителиальных клеток проксимальных почечных канальцев (RPTEC) и нормальных фибробластов легких (NHLF) [32]. Заключение Полученные результаты и литературные данные доказывают высокую токсичность Т-2 токсина на моделях клеточных культур, при этом воздействие токсина коррелирует с его концентрацией. При культивировании перевиваемых ЛЭК в течение 20 ч. в среде DMEM, содержащей высокие дозы токсина (500-6000 нг/мл), отмечалось изменение формы клеток, их фрагментация, отсутствие монослоя, подавление процесса деления и высокий уровень гибели путем апоптоза. Жизнеспособность клеток снижалась на 26,35-59,58%, индекс пролиферации - на 31,67-66,67%, митотическая активность - на 13,97-41,56%, т.е. цитотоксичность возрастала. При снижении концентрации Т-2 токсина до 50 нг/мл клетки начинали формировать монослой, а их форма становилась эпителиоподобной, при концентрации Т-2 токсина 25 нг/мл клетки имели правильную эпи-телиоподобную форму и образовывали полноценный монослой. Концентрация токсина 25 нг/мл не оказывала губительного воздействия на клетки: коэффициент жизнеспособности, индекс пролиферации и митотический индекс не отличались от контроля. IC50 Т-2 токсина для эпителиальных клеток легкого составила 1000 нг/мл, максимально переносимая доза - 25 нг/мл при существующем ПДК в продуктах питания 100 нг/г. Таким образом, поступление в организм Т-2 токсина даже на уровне предельно допустимых концентраций может стать причиной возникновения местных патологических очагов в легких, индукции патогенеза заболеваний различной природы и нарушений системного характера, что указывает на необходимость пересмотра предельно допустимой концентрации Т-2 токсина в продуктах питания. благодарности Работа выполнена при поддержке ФГБУ «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» (Фонд содействия инновациям) в рамках выполнения Соглашения о предоставлении гранта на выполнение научноисследовательских работ за № 10244ГУ/2015.

About the authors

I. I Idiyatov

Federal center of Toxicological, Radiological and Biological Safety

Kazan, Russia

L. R Valiullin

Federal center of Toxicological, Radiological and Biological Safety

Kazan, Russia

V. V Biryulya

Federal center of Toxicological, Radiological and Biological Safety

Kazan, Russia

N. G Shangaraev

Federal center of Toxicological, Radiological and Biological Safety

Kazan, Russia

I. S Raginov

Kazan State Medical University

Kazan, Russia

M. I Tremasov

Federal center of Toxicological, Radiological and Biological Safety

Kazan, Russia

M. V Lekishvili

N.N. Priorov Central Research Institute of Traumatology and Orthopedics

Moscow, Russia

A. I Nikitin

Federal center of Toxicological, Radiological and Biological Safety

Kazan, Russia

References

Supplementary files