Frequencies of the KITLG, BAK1 and SPRY4 alleles and genotypes associating with the development of testicular germ cell tumors, are increased in patients with testicular microlithiasis

Full Text

Введение Микролиты паренхимы яичка являются случайной находкой при ультразвуковом исследовании (УЗИ) органов мошонки и встречаются с частотой примерно до 9%, однако общепопуляционная частота остается неизвестной [1]. Считают, что в основе тестикулярного микролити-аза (ТМ) лежат нарушения фагоцитарной активности клеток Сертоли, что может являться проявлением синдрома тестикулярной дисгенезии (СТД). При ми-кролитиазе клетки, слущенные в просвет семенных канальцев, не уничтожаются посредством фагоцитоза и в дальнейшем подвергаются кальцификации, образуя мелкие кальцинаты [2]. При УЗИ ТМ представляет собой множество мелких гиперэхогенных включений без акустической тени размером 1-3 мм по всей паренхиме яичка (рис. 1). Максимальное количество кальцинатов на одном изображении может значительно варьировать. Классический ТМ определяют по наличию пяти и более микролитов на одном изображении УЗИ (I стадия - 5-10, II стадия - 11-20, III стадия - более 20 включений), в то время как ограниченный ТМ констатируют при наличии менее пяти кальцина-тов на всех изображениях [3]. Частота обнаружения ТМ по УЗИ характеризуется широким диапазоном. Это объясняется отсутствием четкого определения понятия ТМ, неоднородностью исследуемых групп, а также использованием различных частот ультразвука. У взрослых, имеющих симптомы со стороны органов мошонки, средняя частота ТМ варьирует в диапазоне 0,6-9,0%, а у лиц без каких-либо симптомов - 2,4-5,6%. Распространенность бессимптомного ТМ в возрасте до 18 лет составляет 2,4% и увеличивается с возрастом [4]. Хотя взаимосвязь между ТМ и герминогенными опухолями яичек (ГОЯ) отражена в ряде исследований, нет убедительных доказательств, что ТМ является предраковым состоянием [5]. Частота развития ГОЯ у пациентов ТМ составляет от 3 до 10%, при этом большинство больных были направлены на УЗИ в связи с различными жалобами со стороны мошонки, включая перекрут яичка, безболезненное уплотнение, гидроцеле, тестикулярную боль, эпидидимит и субфертильность. Лишь в редких случаях развитие ГОЯ происходило после идентификации ТМ. Рис. 1. Классическая эхографическая картина микролитиаза. Множественные мелкие эхогенные нетеневые очаги по всей паренхиме яичка По данным ряда исследований опухоль развивалась в сроки от 6 мес. до 11 лет после обнаружения ТМ. Относительное увеличение риска развития опухоли у мужчин с ТМ в исследуемых популяциях возрастало в 13,2-21,6 раза [6]. В последнее время благодаря полногеномным ассоциативным исследованиям удалось идентифицировать гены, которые участвуют в нормальном развитии ткани яичек и сперматогенезе. Определенное аллельное состояние этих генов приводит к повышенному риску развития ГОЯ [7]. Показано, что некоторые однонуклеотидные полиморфизмы в генах KITLG, SPRY4 и BAK1 влияют на развитие мужского бесплодия и приводят к значительному повышению риска развития ГОЯ [8]. С целью выявления генетических факторов, определяющих повышенный риск развития ГОЯ у пациентов с ТМ, мы провели исследование аллелей и генотипов KITLG (rs995030, rs1508595), SPRY4 (rs4624820, rs6897876) и BAK1 (rs210138) в группах пациентов с диагнозом герминогенных опухолей яичек, пациентов с тестикулярным микролитиа-зом и фертильных мужчин (контрольная группа). материал и методы Материал для исследования (сыворотка крови пациентов с ГОЯ в возрасте от 28 до 45 лет, n = 73) был любезно предоставлен кафедрой урологии и хирургической андрологии РМАПО на базе ГКБ им. С.П. Боткина, а также отделением клинической фармакологии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Диагноз ГОЯ установлен по результатам морфологического исследования. Набор материала от пациентов с ТМ осуществили отдел детской хирургии НИЦ РМАПО и кафедра детской эндокринологии на базе ДГКБ им. З.А. Башляевой. В группу с ТМ вошли 56 детей от 2 до 18 лет (средний возраст 12,05±0,66). Микролитиаз был выявлен при УЗИ мошонки на аппаратах Voluson 730 PRO V (General Electric Company, США), Mindray DC-7 (Shenzhen Mindray Bio-Medical ElectronicCo. Ltd., Китай) с применением линейных датчиков высокой частоты (12-13 МГц). Диагноз ТМ ставили при обнаружении трех и более мелких (1-3 мм) гиперэхогенных включений без акустической тени в паренхиме яичка [9]. Показаниями к УЗИ мошонки служили варикоцеле, крипторхизм, атрофия яичек, гидроцеле, острые заболевания мошонки, нарушения формирования пола. У части пациентов ТМ был выявлен во время диспансеризации. В качестве контроля использовали ДНК, выделенную из периферической крови фертильных доноров (n = 97), в возрасте от 26 до 41 г., не имеющих в анамнезе герминогенных опухолей яичек. Взятие образцов крови производилось при наличии информированного согласия взрослых пациентов (с 14 лет), родителей пациентов-детей в возрасте до 14 лет и доноров. ДНК из лейкоцитов периферической крови пациентов с ГОЯ, детей с ТМ и фертильных мужчин выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции, описанным J. Sambrook (1989) [10]. Определение аллелей и генотипов KITLG (rs995030, rs1508595), SPRY4 (rs4624820, rs6897876) и BAK1 (rs210138) осуществляли методом ПЦР-ПДРФ. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы Prism 6 (Graph Pad Prism version 6.0). Аллельные варианты полиморфных генов сопоставляли по наличию аллелей и генотипов у пациентов с ГОЯ, ТМ и в группе контроля. Тест на соответствие выборки равновесию Харди-Вайнберга проводили методом %2 (а = 0,05, df = 1), анализ ассоциаций - расчетом показателя отношения шансов (OR-odds ratio) с 95% доверительным интервалом (95% CI). Достоверность ассоциации между заболеванием и аллельным вариантом (генотипом) определяли с помощью точного двустороннего критерия Фишера, критерия %2 (c коррекцией Йейтса на непрерывность выборки), df = 2 (общая модель наследования), либо U-критерия Манна - Уитни, сравнивая распределение генотипов и аллелей по каждому полиморфизму между группами пациентов и контролем. Сравнение частот встречаемости сочетаний генотипов проводили с использованием точного двустороннего критерия Фишера. Для всех критериев статистически значимыми считали различия при р<0,05. результаты Частоты аллелей и генотипов, определенные в группе пациентов с ГОЯ, ТМ и в контроле, представлены в табл. 1. Для KITLG были выявлены достоверные различия частоты генотипа GG rs995030 у пациентов с ТМ (р = 0,01 3) и пациентов с ГОЯ (р = 0,0031) по сравнению с контролем. При ТМ и ГОЯ достоверно чаще определялись аллель G (p = 0,002 и р = 0,0003 соответственно) и генотип GG (p = 0,01 и p = 0,014) по rs1508595. Для BAK1 (rs210138) были обнаружены достоверные различия частоты аллеля G в группе пациентов с ТМ по сравнению с контрольной группой (р = 0,03). Для гена SPRY4 (rs4624820, rs6897876) достоверных различий в частотах аллелей и генотипов в группах ТМ и ГОЯ по сравнению с контролем отмечено не было. При исследовании сочетания генотипов высокого риска KITLG (rs995030, rs1508595) и BAK1 (rs210138) было показано, что их сочетание у пациентов с ГОЯ (p = 0,0001) и пациентов с ТМ (p = 0,0053) встречается достоверно чаще по сравнению с контролем (табл. 2). Поскольку в нашей выборке генотип GG по BAK1 rs210138 был обнаружен только у 1 пациента с ТМ и 2 пациентов с ГОЯ, расчет риска проводили для генотипов GG+AG. Было отмечено увеличение риска развития опухоли при сочетании генотипов KITLG (rs995030, rs1508595) и BAK1 (rs210138) в группе ГОЯ в 4,6 раза (OR: 4,669 [2, 172-10, 034]), а в группе ТМ в 3,3 раза (OR: 3,355 [1,471-bORR~7,654]). обсуждение Герминогенные опухоли яичек являются наиболее распространенными злокачественными новообразованиями у мужчин в возрасте 15-40 лет и встречаются с частотой 1-3%. Раннее обнаружение ГОЯ улучшает прогноз и предотвращает необходимость в радикальном хирургическом лечении (орхиоэкто-мии), а также способствует проведению органосохраняющих операций и снижает риск последствий системного противоопухолевого лечения. Микролитиаз яичек наряду с недостаточностью репродуктивной функции, атрофией яичка, криптор-хизмом рассматривают в качестве факторов риска для развития ГОЯ. Поэтому обнаружение ТМ может способствовать выявлению группы пациентов, имеющих высокий риск развития опухоли. таблица 1. Частоты аллелей и генотипов генов, ассоциированных с повышенным риском развития ГОЯ, по данным GWAS, у пациентов с ГОЯ, ТМ и здоровых мужчин (К) Гены SPRY4 KITLG BAK1 Аллели rs4624820 rs6897876 rs995030 rs1508595 rs210138 Генотип А АА С СС G GG G GG G GG К (n = 97) 0,546 0,28 0,56 0,397 0,763 0,546 0,665 0,464 0,165 0/0,0 ГОЯ (n = 73) 0,62 0,39 0,63 0,33 0,842 0,753* 0,842* 0,739* 0,247 0,028 ТМ (n = 56) 0,616 0,375 0,286 0,464 0,795 0,679* 0,83* 0,714* 0,268* 0,018 * - аллели и генотипы, частота которых статистически значимо отличается от контрольной группы, р<0,05. таблица 2. Распределение частот встречаемости сочетания генотипов риска: GG, GG, AG/GG, для генов KITLG и BAK1 в исследуемых группах Сочетание генотипов риска: rs995030(GG), rs1508595(GG), rs210138(AG/GG) Группы Сочетание + Сочетание - ГОЯ (n = 73) 29/0,4 44/0,6 ТМ (n = 56) 18/0,32 38/0,68 Контроль (n = 97) 12/0,12 85/0,88 p (ГОЯ - ТМ - К) 0,0002 p (ГОЯ vs К) 0,0001; OR: 4,669 [2, 172-10, 034]; RR: 3,211 [1, 762-5, 854] p (ТМ vs К) 0,0053; OR: 3,355 [1,471-bORRA7,654]; RR: 2,598 [1, 353-4, 989] J. Coffey с соавт. (2007) показали, что ТМ чаще встречается у мужчин, родственники которых имели ГОЯ, что предполагает семейный фактор риска для рака яичек [11]. Существует гипотеза, что ТМ и ГОЯ, скорее всего, являются вторичными по отношению к общему дефекту, тубулярной дегенерации, что объясняет связь между ГОЯ и ТМ [12]. TM является маркером тубулярной дегенерации, но сам по себе не является фактором риска, предрасполагающим к развитию тестикулярного рака. Подавляющее число доказательств указывают на то, что ТМ может выступать в качестве маркера только у тех мужчин, которые имеют дополнительные факторы риска для ГОЯ (крипторхизм, бесплодие, а также другие факторы) [13]. Нам удалось показать, что генетические факторы, значимые для развития ГОЯ, достоверно чаще представлены и в группе пациентов с ТМ. Генотипы AA для SPRY4 (rs4624820), CC для SPRY4 (rs6897876), GG для KITLG (rs995030), GG для KITLG (rs1508595) и GG для BAK1 (rs210138) по результатам полногеномного исследования ассоциаций и по полученным нами данным связаны с высоким риском развития ГОЯ [14]. Низкое качество спермы, крипторхизм, рак яичка и гипоспадия могут характеризовать синдром тестикулярной дисгенезии СТД, который формируется под влиянием генетических факторов и факторов окружающей среды [11]. Экспериментальные и эпидемиологические данные показывают, что СТД является результатом нарушения программирования и развития гонад в эмбриональный период. Поэтому будущие эпидемиологические исследования в области репродуктивного здоровья мужчин не должны ориентироваться на один симптом, необходимо принимать во внимание все аспекты СТД. выводы 1. Полученные данные привносят дополнительные аргументы в пользу гипотезы о том, что тестикулярный микролитиаз, по крайней мере, в части случаев, является одним из симптомов дисгенезии яичек, наряду с крипторхизмом, гипоспадией, нарушениями фертильности и ГОЯ. 2. Генетическое исследование может быть использовано для выявления лиц группы повышенного риска по развитию ГОЯ среди пациентов с тестикулярным микролитиазом. 3. Дети и лица репродуктивного возраста с микролитиазом, у которых выявляют полиморфные варианты гена KITLG и сочетание генотипов высокого риска по двум генам KITLG (rs995030, rs1508595) и BAK1 (rs210138) должны наблюдаться как лица, имеющие повышенный риск развития герминогенных опухолей яичек. Необходимо ежегодное проведение УЗИ яичек с допплерографией, а с наступлением пубертата и до конца репродуктивного периода ежегодно исследовать онкомаркеры. Выявление даже косвенных признаков внутриканальцевой неоплазии обуславливает необходимость проведения биопсии яичка.

About the authors

I. S Dantzev

Russian medical academy of postgraduate education

Moscow, Russia

E. V Ivkin

N.N. Blokhin Russian Onctological Scientific Center

Moscow, Russia

A. A Tryakin

N.N. Blokhin Russian Onctological Scientific Center

Moscow, Russia

A. A Bulanov

N.N. Blokhin Russian Onctological Scientific Center

Moscow, Russia

D. N Godlevski

Russian medical academy of postgraduate education

Moscow, Russia

O. Y Latyshev

Russian medical academy of postgraduate education

Moscow, Russia

V. V Rudenko

N.N. Blokhin Russian Onctological Scientific Center

Moscow, Russia

S. A Tyulyandin

N.N. Blokhin Russian Onctological Scientific Center

Moscow, Russia

E. A Volodko

Russian medical academy of postgraduate education

Moscow, Russia

A. B Okulov

Russian medical academy of postgraduate education

Moscow, Russia

O. B Loran

Russian medical academy of postgraduate education

Moscow, Russia

M. V Nemtsova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia; Russian medical academy of postgraduate education

Moscow, Russia

References

Supplementary files