The dependence of proliferation rate of human dermal fibroblasts on growth medium composition and fetal bovine serum concentration

Full Text

Введение В современной регенеративной медицине важное место занимает использование фибробластов дермы человека, выделенных из биоптата кожи, для восстановления целостности кожных покровов. Культивируемые фибробласты, как ауто-, так и аллогенные, находят применение в травматологии, комбустиологии, пластической хирургии и косметологии [1-4]. Преимуществом аутогенных фибробластов являются более продолжительный клинический и косметический эффекты, при этом также исключается риск передачи реципиенту инфекционных агентов от донора. Единственный недостаток аутогенных клеток - для их экспансии до необходимого количества требуется не менее трех недель. Полученные in vitro фибробласты формируют структурную основу для эпителизации раневой поверхности, продуцируя белки внеклеточного матрикса и широкий спектр факторов роста, стимулирующих пролиферацию собственных фибробластов и кератиноцитов пациента [5]. Внедрение в лабораторную практику технологии автоматизированного культивирования клеток позволяет стандартизировать процесс производства e-mail: fdf79@mail.ru клеточных культур и привести его в соответствие требованиям GMP [6]. При подготовке больших объемов клеточного материала для терапевтического применения необходима оптимизация технологии культивирования, в том числе подбора состава ростовой среды и концентрации сыворотки, обеспечивающих наиболее высокую пролиферативную активность фибробластов (принимая во внимание высокую стоимость этих компонентов). Кроме того, необходимость применения в терапии ожоговых ран аутогенных фибробластов исключает возможность заблаговременной подготовки клеточного материала и требует максимального сокращения срока его получения из взятого от пациента биоптата. Эффективность колониеобразования и время удвоения популяции фибробластов при использовании низкосывороточных и бессывороточных сред ранее были определены в работе В. Зорина с соавт. (2014) [7]. Однако сравнительные данные по пролиферативной активности дермальных фибробластов на различных типах культуральных сывороточных сред, а также по зависимости данного показателя от концентрации сыворотки в среде, в доступных литературных источниках фрагментарны и разрозненны. Цель исследования - оценить влияние состава культуральной среды и концентрации сыворотки на пролиферативную активность фибробластов дермы и подобрать оптимальные для технологии автоматизированного культивирования клеток тип питательной среды и концентрацию сыворотки. материал и методы Выделение и культивирование фибробластов осуществляли по модифицированным протоколам A. Takashima (1999) [8]. Две линии фибробластов дермы были получены из образцов кожи здоровых доноров после подписания ими добровольного информированного согласия. Фибробласты были выделены из образцов методом диссоциации ткани с использованием коллагеназы I Clostridium histolyticum (Sigma-Aldrich, США). Экстрагированные клетки культивировали во флаконах Т25 (Nunc, Дания) в среде DMEM/F-12 (1:1, Gibco, США) с добавлением 0,03% глутамина и 10% фетальной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США) до формирования участков клеточного монослоя, общая площадь которых составляла не менее 30% от площади флакона, после чего клетки пересевали. Снятие клеток с пластика проводили 0,25% раствором трипсина с добавлением ЭДТА (Gibco, США). Последующие пересевы осуществляли после достижения 90% конфлюэнтности клеточного монослоя. Для экспериментов использовали клетки 7-8 пассажей. Для оценки влияния концентрации сыворотки на пролиферативную активность фибробласты культивировали в средах с различным содержанием данного компонента (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40 и 50%). В лунки 96-луночного планшета (Corning, США) вносили по 50 мкл суспензии фибробластов (плотность посева 1500 кл/см2) в среде DMEM/F-12 (без сыворотки), после чего в те же лунки вносили соответствующие количества фетальной телячьей сыворотки в зависимости от требуемой конечной концентрации и доводили средой DMEM/F-12 общий объем смеси в лунке до 100 мкл. Клетки в планшетах инкубировали при 37°С в атмосфере с 5% СО2 в течение 5 сут. Пролиферативную активность фибробластов оценивали по показателю среднего времени удвоения клеточной популяции [9], который рассчитывали по формуле: - Т t loS2 где t - среднее время удвоения клеточной популяции; Т - время культивирования клеток (ч.); N - плотность клеточного монослоя после окончания культивирования (кл/см2); N0 - плотность посева (кл/см2); log2(N/N0) - количество удвоений клеточной популяции за время Т. Для получения достоверного результата при использовании формулы показатель N должен как минимум в 2 раза превышать показатель N0. Для подбора оптимальной ростовой среды для экспансии фибробластов с использованием технологии автоматизированного культивирования исследовали различающиеся по составу базовые и улучшенные среды производства Gibco (США) и ПанЭко (Россия), а также их смеси: 1) DMEM/Ham's F-12, 1:1 (DMEM/F-12, Gibco) 2) Advanced DMEM (Gibco) 3) Advanced DMEM+Ham's F-12, 1:1 (Gibco) 4) Advanced DMEM+RPMI-1640, 1:1 (Gibco) 5) aMEM (Gibco, США) 6) aMEM + Ham's F-12, 1:1 (Gibco) 7) aMEM + RPMI-1640, 1:1 (Gibco) 8) DMEM (ПанЭко) 9) DMEM + Ham's F-12 , 1:1 (ПанЭко) 10) DMEM+RPMI-1640, 1:1 (ПанЭко) Суспензию фибробластов в ростовой среде с добавлением 10% сыворотки (Sigma, США) вносили в лунки 96-луночного планшета с плотностью посева 1500 кл/см2 и инкубировали в течение 5 сут. при 37°С в атмосфере с 5% СО2. Подсчет количества жизнеспособных фибробластов проводили с помощью их окраски трипановым синим после снятия клеток с пластика 0,25% раствором трипсина с ЭДТА. Оценку пролиферативной активности фибробластов проводили в 6 повторениях для каждой концентрации сыворотки и для каждого типа среды с последующим расчетом среднего арифметического и стандартного отклонения. Для статистической обработки полученных данных применяли U-критерий Манна - Уитни при уровне значимости различий p<0,05. Вычисления проводили с помощью программы Microsoft Excel 2007. результаты и обсуждение По данным литературы, наиболее высокая пролиферативная активность клеток in vitro обычно отмечается при концентрации сыворотки 15-20% [10, 11], однако в протоколах культивирования фибробластов указывается диапазон рекомендуемой концентрации сыворотки от 10 до 20% [8, 12]. Для оценки зависимости пролиферативной активности от концентрации сыворотки фибробласты дермы двух популяций, полученных от разных доноров (линия 1, линия 2), культивировали в ростовой среде с различным содержанием фетальной телячьей сыворотки. Низкая посевная доза (1500 кл/см2) позволяла увеличить количество делений клеток в среде с заданной концентрацией сыворотки и тем самым свести к минимуму возможный побочный эффект, обусловленный культивированием клеток до начала эксперимента в среде иного состава. Результаты эксперимента с обеими линиями фибробластов представлены на рис. 1. При повышении концентрации сыворотки до 20% наблюдалось увеличение плотности сформировавшегося клеточного монослоя. Дальнейшее повышение концентрации сопровождалось снижением пролиферативной активности фибробластов, очевидно, обусловленным цитотоксическим эффектом сыворотки (данные не представлены). Использованные в эксперименте линии фибробластов имели разные значения среднего времени удвоения популяции, однако общая закономерность его зависимости от концентрации сыворотки была схожей. На рис. 1 представлены значения данного показателя при концентрации сыворотки от 4% и выше, так как при более низком содержании сыворотки плотность сформировавшегося клеточного монослоя была недостаточна для подсчета. Экспоненциальное снижение времени удвоения наблюдалось в диапазоне от 0 до 12% сыворотки, после чего происходит относительная стабилизация данного показателя, и при дальнейшем повышении концентрации он уменьшается незначительно. Для линии 1 при концентрации сыворотки 12% среднее время удвоения клеточной популяции составило 35,3±2,0 ч., при концентрации 20% - 31,1±0,8 ч.; для линии 2 - 28,3±0,6 ч. и 23,7±0,7 ч., соответственно (рис. 1). При подборе оптимальной среды для культивирования фибробластов был использован набор различных сред и их смесей производства Gibco и ПанЭко. Результаты, полученные с использованием обеих линий клеток, представлены на рис. 2. Рис. 1. Зависимость плотности монослоя (столбцы) и среднего времени удвоения популяции (линейный график) фибробластов дермы от концентрации сыворотки Рис. 2. Зависимость плотности монослоя (столбцы) и среднего времени удвоения популяции (линейный график) фибробластов дермы от типа культуральной среды Наиболее высокая пролиферативная активность клеток линии 1 была отмечена при использовании сред aMEM и Advanced DMEM + F-12 производства Gibco: среднее время удвоения популяции составило 30,3±0,5 ч. и 31,3±1,1 ч., соответственно, но различия плотности сформировавшегося монослоя не были статистически значимы. В эксперименте с линией 2 среднее время удвоения было наименьшим при использовании сред aMEM + F-12 (32,2±0,5 ч.) и Advanced DMEM+RPMI (33,8±1,2 ч.). Обнаруженные индивидуальные особенности обеих линий фибробластов, связанные с типом культуральной среды, при использовании которой клетки проявляют максимальную пролиферативную активность, вполне закономерны. В работе M. Ahearne с соавт. (2014) показано, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), также способные дифференцироваться в фибробластиче-ском направлении, выделенные от разных доноров (или от одного донора, но разных пассажей), проявляли максимальную пролиферативную активность на разных культуральных средах [13]. Для получения усредненной оценки влияния состава ростовой среды на пролиферативную активность фибробластов был использован относительный показатель, характеризующий соотношение плотности сформированного клеточного монослоя при использовании различных ростовых сред. За 100% в этом случае условно принималась плотность клеточного монослоя при использовании среды DMEM/F-12 (Gibco). Использование относительного показателя плотности клеточного монослоя позволило нивелировать влияние различий в пролиферативной активности между фибробластами из разных линий, не связанных с составом ростовой среды. Средние значения данного показателя по обеим линиям фибробластов представлены на рис. 3. Наиболее часто используемыми для культивирования фибробластов питательными средами являются DMEM или DMEM/F-12 [8, 14, 15]. Однако при использовании обеих сред относительная пролиферативная активность фибробластов дермы обеих популяций была невысокой. Максимальное значение данного показателя было отмечено на среде aMEM, на смеси сред aMEM с F-12, а также на смесях среды Advanced DMEM с F-12 и RPMI-1640 (около 140% от аналогичного показателя на среде DMEM/F-12). Полученный результат согласуется с данными P. Sotiropoulou с соавт. (2009), которые показали, что максимальная пролиферативная активность ММСК отмечалась на среде aMEM, тогда как на среде DMEM она была относительно невысокой [16]. При этом уровень пролиферации фибробластов при культивировании на базовой среде aMEM не уступал данному показателю при использовании улучшенных сред Advanced DMEM. Существенных различий в пролиферативной активности клеток при использовании F-12 и RPMI-1640 (Gibco) не было выявлено, несмотря на то, что среда RPMI-1 640 предназначена для культивирования клеток лейкоцитарного происхождения и, в отличие от среды F-12, для фибробластов обычно не используется. Интересно также отметить отсутствие значимых различий пролиферативной активности при использовании среды Е1МЕМ^-12 производства Gibco и смеси сред □МЕМ + F-12 производства ПанЭко. Рис. 3. Относительная пролиферативная активность фибробластов при использовании различных типов ростовой среды. Плотность клеточного монослоя при использовании среды DMEM/F-12 (Gibco) принята за 100% Выводы 1. Увеличение пролиферативной активности фибробластов при повышении концентрации сыворотки в питательной среде от 0 до 20% носит неравномерный характер. Экспоненциальное снижение среднего времени удвоения клеточной популяции наблюдается в интервале 0-12%, дальнейшее увеличение содержания сыворотки сопровождается незначительным изменением данного показателя. Оптимальной концентрацией сыворотки можно считать 12%. 2. Зависимость пролиферативной активности фибробластов от состава культуральной среды носит индивидуальный характер для конкретной клеточной линии. В целом, наиболее высокая скорость пролиферации наблюдается при использовании питательных сред aMEM и Advanced DMEM с добавлением F-12 или RPMI-1640 (Gibco).

About the authors

F. A Fadeyev

Ural State Medical University;Institute of Medical Cell Technologies

Ekaterinburg, Russia

D. V Lugovets

Institute of Medical Cell Technologies

Ekaterinburg, Russia

M. V Ulitko

Institute of Medical Cell Technologies

Ekaterinburg, Russia

S. L Leontyev

Institute of Medical Cell Technologies

Ekaterinburg, Russia

S. V Sazonov

Ural State Medical University; Institute of Medical Cell Technologies

Ekaterinburg, Russia

References

Supplementary files