Histological features of the lipograft with platelet-rich plasma after subcutaneous transplantation in vivo

Full Text

Введение Эффективное реконструктивно-восстановительное лечение пациентов с дефектами и деформациями мягких тканей лица является важной задачей челюстно-лицевой хирургии, решение которой требует применения материалов, способных восполнить утраченные объемы мягких тканей [1-3]. e-mail: ilonadzampaeva@yahoo.com За многолетнюю историю развития методов оперативного лечения при данных показаниях было предложено значительное количество различных материалов, но в клинической практике закрепились только безопасные, биосовместимые и длительно сохраняющие объем после имплантации / трансплантации [4]. Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 71 Современные материалы, применяющиеся для восстановления формы, контуров мягких тканей лица, по происхождению могут быть разделены на три группы: аутогенные (дерма, фасция, жир, хрящ, скелетные мышцы, капсула молочной железы и др. ); алло- и ксеногенные (хрящ, коллагеновый матрикс, дерма, фасция, твердая мозговая оболочка, гиалуроновая кислота); синтетические (силикон, по-лиметилметакрилат, изделия на основе полимеров органических кислот и др. ) [4]. Большинство авторов отдают предпочтение материалам первой группы, так как они отличаются наибольшей безопасностью: отсутствием токсического воздействия, аллергических реакций, низким риском инфицирования по сравнению с материалами других групп [5]. Учитывая требования, предъявляемые к материалам, а также накопленный опыт успешного применения, в последние годы все более широко используется аутотрансплантация жировой ткани [1-3, 6, 7]. Впервые, использование собственного жира пациента для увеличения объема мягких тканей описал G. Nueber в 1893 г. [8], заложив, тем самым, основы для внедрения данного метода в клиническую практику. Дальнейший опыт использования аутогенного жира связан с трудами Е. Hollander (1912) [9] и H. Neuhof (1923) [10]. Однако результаты первых случаев свободной аутотрансплантации жировой ткани не были долгосрочными Временность эффекта липофилинга в виду быстрой биорезорбции трансплантированной жировой ткани, особенно под действием механических нагрузок, давления, вплоть до настоящего времени является основной проблемой, ограничивающей эффективность подхода [7]. Так, показано, что в течение первых 6-12 мес. после трансплантации от 20 до 70% введенной жировой ткани (липографта) может резорбироваться [11]. Описаны различные факторы, влияющие на выживаемость жирового трансплантата: способ его забора (ручной или механический); вид анестезии и метод инфильтрации донорской и реципиентной областей; разведение анестетика; метод очистки жировой ткани от крови и других смежных компонентов (отстаивание, центрифугирование, промывание в закрытой или открытой фильтрационных системах); техника и объем введения; послеоперационные процедуры [7]. В основе резорбции лежат недостаточное кровоснабжение трансплантированных липографтов, гипоксия, негативное воздействие продуктов разрушения клеток, влекущие к активации апоптоза адипоцитов, пролиферации фибробластов, образованию «жировых кист» и фиброзированию. В этой связи, наилучшей приживаемостью и длительностью эффекта характеризуются цельные жировые аутотрансплантаты Однако их получение и введение требует открытых операционных доступов, то есть не осуществимо в малоинвазивном варианте Наиболее очевидными и широко применяющимися способами для увеличения продолжительности эффекта липофилинга являются гиперкоррекция (введение несколько больших, чем нужно, объемов жировой ткани), повторные вмешательства, а также применение наиболее щадящих методов технологической обработки липографтов [11, 12]. Однако понимание основных механизмов и патогенетических факторов биорезорбции жировых аутотранплантатов формирует основы для разработки потенциально более эффективных методов увеличения сроков «выживаемости» липографтов [13, 14]. К таким методам относятся добавление к жировым трансплантатам плазмы, обогащенной тромбоцитами (platelet-rich plasma, PRP) [15], плазмы, обогащенной факторами роста (plasma rich in growth factors, PRGF), клеток стромально-васкулярной фракции жировой ткани [16], фибрина, обогащенного тромбоцитами [17]. В ряде работ уже показано положительное влияние тромбоцитарных факторов роста на сохранность липографтов: отмечается снижение воспалительной реакции и количества жировых кист, увеличение количества жизнеспособных ади-поцитов и кровеносных сосудов [15, 18]. Однако опубликованные гистологические данные, зачастую, противоречивы, не содержат детального анализа компенсаторно-адаптационных реакций на клеточном и тканевом уровнях В этой связи, целью исследования являлся анализ структурных изменений липографтов после их аутотрансплантации, а также влияние PRP на этот процесс Материал и методы Дизайн исследования Экспериментальное исследование выполнено на кроликах-самцах породы Шиншилла (n = 9), средним весом 2-2,5 кг, возрастом 10-12 мес. , с соблюдением международных правил гуманного обращения с лабораторными животными От каждого животного забирали 2 образца жировой ткани, один из которых смешивали с PRP (экспериментальная группа); контролем служил липографт без PRP трансплантаты вводили подкожно через дорсальную поверхность наружного уха: образцы контрольной группы - в левое, а экспериментальное - в правое ухо. Животных выводили из эксперимента на сроках 1, 2, 4, 8 и 36 нед , зоны трансплантации подвергали гистологическому исследованию Эксплантация жировой ткани После премедикации (Атропин 0,04 мг/кг, Цефа-золин 25 мг/кг) внутримышечно и внутримышечной седации (Sol. Zoletili 100 - 0,5 мл) под местным обезболиванием (Sol. Ultracaini 1,7 мл в 7 мл 0,9% раствора NaCL) осуществлялась эксплантация жировой ткани кроликов из лопаточной области На спине, по средним линиям правой и левой лопаточных областей выполнялись вертикальные разрезы кожи длиной 12 мм При помощи ножниц обнажались и отсекались фрагменты подкожно расположенной жировой ткани, объемом около 1 см3. Послеоперационные раны ушивались узловыми швами SurgiPro 4/0 Подготовка жировых трансплантатов Непосредственно после эксплантации фрагменты жировой ткани помещались в отдельные стерильные пробирки, трижды отмывались 10 мл стерильного 0,9% раствора NaCL, измельчались при помощи скальпеля Из краевой вены уха кролика в пробирку с раствором цитрата натрия забирали 5 мл крови Пробирки цетрифугировали на скоростных режимах, предусмотренных компанией Biotechnology institute (Испания), которые не допускают разрушение эритроцитов, Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 72 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ в течение 8 мин. Две верхние фракции (плазма крови и лейкоцитарно-тромбоцитарный слой) объемом 1 мл помещали в отдельную стерильную емкость и добавляли 3-4 капли 10% раствора хлористого кальция (для активации). Один из двух образцов жировой ткани, полученных от каждого животного, пропитывался 1 мл активированной PRP непосредственно перед введением под кожу правого уха Липографтинг Под местным обезболиванием (Sol. Ultracaini 0,5 мл) в нижней трети каждого уха, по средней линии дорсальной поверхности выполнялся поперечный разрез кожи длиной 10 мм С помощью зажима создавался подкожный карман - реципиентное ложе для подготовленных липографтов. Жировые трансплантаты вводились через произведенный доступ, послеоперационные раны ушивались узловыми швами SurgiPro 5/0. Гистологический анализ От животных, выведенных на сроках 1, 2, 4, 8 и 36 нед , забирали фрагменты ушных раковин с зоной ранее выполненного липографтинга и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина Срезы изготавливали по стандартной методике, окрашивали гематоксилином и эозином, а также выполняли иммуногистохимический анализ с антителами к CD163 - маркеру моноцитов/макрофагов. Статистический анализ На первом этапе статистического анализа использовались описательные методы: определение средних значений, стандартных ошибок средних значений, верхних и нижних квартилей, межквар-тильных интервалов. Учитывая непараметрическое распределение количественных признаков, для сравнения групп применяли непараметрический метод - U-критерий Манна - Уитни. Результаты и обсуждение Жировой аутотрансплантат без PRP В ходе исследования было установлено, что уже через 1 нед. жировые аутотрансплантаты без PRP были окружены соединительнотканной капсулой толщиной до 187,5±49,65 мкм (рис. 1А). При этом реактивно измененная рыхлая волокнистая соединительная ткань (РВСТ) капсулы включала в себя элементы организующейся интраоперационной гематомы Снаружи, непосредственно к капсуле прилежала грануляционная ткань При этом жировой аутотрансплантат претерпевал ряд изменений: обнаруживались несколько деформированные и сплющенные оптически пустые вакуоли; междольковая соединительная ткань подвергалась гиперплазии, вследствие чего поперечные размеры междоль-ковых перегородок по ширине были сопоставимы с капсулой, окружающей трансплантат Необходимо отметить, что происходило увеличение межадипоцитарных зон липографта за счет пролиферации клеточных элементов реактивно измененной РВСТ. Данные участки были заполнены активными фибробластами, клетками гемопоэтиче-ского ряда, включая гранулоциты, а также кровеносными сосудами, что «роднит» данную ткань с грануляционной (рис. 1А). Преимущественно в структуре формирующейся соединительнотканной капсулы, но также и в составе жирового аутотрансплантата обнаруживались клеточные элементы макрофагально-гистиоцитар-ной реакции (рис. 2). В составе последнего гистиоциты располагались в межадипоцитарной РВСТ, вблизи сосудов, что, вероятно, обусловлено их миграцией из кровотока Однако нельзя исключить, что макрофаги достигали жирового транплантата, двигаясь в матриксе РВСТ, врастающей со стороны формирующейся капсулы Это положение отчасти подтверждает тот факт, что в центральных участках липографта количество гистиоцитов было наименьшим 1 нед. 2 нед. 4 нед. 8 нед. 36 нед. Рис. 1. Липографты без PRP (А) и смешанные с PRP (Б) в различные сроки после подкожной трансплантации в ушную раковину кролика: 1 - жировая ткань; 2 - соединительнотканная капсула; 3 - соединительнотканные междольковые перегородки; 4 - сохранившиеся островки гипотрофичных адипоцитов; 5 - плотная волокнистая соединительная ткань; 6 - кровеносные сосуды. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. : А - 1, 36 нед. х100; А - 2 нед. х200; А - 4, 8 нед. х40; Б - 1 нед. х40; Б - 2 нед. х100; Б - 4-36 нед. х200 Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 73 Через 2 нед. отмечалось увеличение интенсивности раннее выявленных изменений. Вследствие потери жиров и развития межадипоцитарной соединительной ткани усиливалась гетероморфность ади-поцитов (рис. 1А). так же, как и на предыдущем сроке, признаки выраженной воспалительной реакции не обнаруживались. При этом толщина соединительнотканных тяжей, разделяющих жировые дольки, достигала несколько сотен мкм. У некоторых животных не выявлялась гиперплазия соединительной ткани, хотя объем долек жирового трансплантата снижался за счет уменьшения жировых вакуолей адипоцитов. Через 4 нед. жировой аутотрансплантат почти полностью замещался волокнистой соединительной тканью При этом единичные крупные адипоциты или свободные капли жира оказывались «разбросанными» по структуре соединительнотканного рубца (рис. 1А). Через 8 нед. жировой аутотрансплантат полностью замещался плотной волокнистой соединительной тканью, вокруг которой определялась капсула толщиной 300-330 мкм. Указанные гистологические характеристики сохранялись до крайнего срока наблюдения - 36 нед. (рис. 1А). Жировой аутотрансплантат с PRP Добавление PRP к жировому аутотрансплантату приводило к некоторым изменениям в динамике посттрансплантационных процессов, охарактеризованных выше. Так, через 1 нед. вокруг жирового ауто-транплантата с PRP определялась соеднительноткан-ная капсула и умеренная гиперплазия междольковой РВСТ, однако столь выраженных, как в контрольной группе, пролиферативных изменений РВСТ межади-поцитарных зон не наблюдалось (рис. 1Б). Толщина капсулы была статистически значимо меньшей, чем в контроле, составляя в среднем 123,1 ±60 мкм. Аналогичная разница наблюдалась и на последующем сроке В последующие сроки наблюдалось прогрессивное снижение количества адипоцитов, площадей, занятых жировыми дольками, что сопровождалось уменьшением объемов трансплантатов и их фибро-зированием. Однако вплоть до 4 нед. содержание жировых элементов трансплантата было большим в случае применения PRP (рис. 1Б). Только на сроке в 8 нед. жировой аутотрансплантат с PRP подвергался практически полному замещению РВСТ. Разницы в гистологических особенностях инволютивных изменений трансплантатов экспериментальной и контрольной групп на сроке 36 нед не наблюдалось: на месте липографта обнаруживалось «соединительнотканное образование», выполненное преимущественно плотной неоформленной волокнистой соединительной тканью (рис. 1Б). Воздействие PRP на жировую ткань было ранее изучено как in vitro, так и in vivo. Полученные нами результаты, отчасти, коррелируют с данными других экспериментальных исследований, свидетельствующих о положительном влиянии PRP на трансплантированный липографт [19-22]. Однако, если в других исследованиях авторы показали, что количество жизнеспособных адипоцитов и кровеносных сосудов в группах с PRP выше, чем в контрольных, характеризующихся наличием участков некроза жировых трансплантатов, то в нашей работе разница между группами не была столь существенной. Положительное влияние PRP в значительной степени проявлялось в виде замедления классической динамики инволютивных изменений, характерных для липографта без PRP Важно отметить, что в нашем исследовании гистологические характеристики изменения жировых трансплантатов оценивались на протяжении 9 мес. , тогда как стандартные сроки наблюдения, как правило, не превышают 6 мес. [21, 22]. Однако разницы на крайних сроках наблюдения мы не обнаружили, что позволяет считать сроки до 6 мес достаточными для оценки посттрансплантационных изменений липографтов. Необходимо отметить, что не все исследования по данной теме имеют сходные результаты Так, Y. C. Por с соавт. (2009) в эксперименте на имму-нодефицитных мышах показали отсутствие статистически значимой разницы между результатами липографтинга с PRP и без нее [23]. Противоречия в результатах указанных исследований могут быть обусловлены как различиями экспериментальных моделей, методик очистки жировой ткани и обработки липографтов PRP, так и с разницей в полученных образцах PRP 1 2 Ч; г V / : А- • ** ■ и Ж * Ч • Рис. 2. Липографт без PRP через 1 нед. просле подкожной трансплантации, макрофагально-гистиоцитарная реакция: 1 - соединительнотканная капсула; 2 - жировая ткань трансплантата. Иммуногистохимическая реакция с антителами к CD163 (коричневый цвет), докраска гематоксилином. Ув.: А х200, Б х400 Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 74 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Заключение Динамика тканевых реакций, происходящих со свободным жировым аутотрансплантатом, представлена последовательной сменой нескольких этапов: потеря жирового компонента (уменьшение жировых вакуолей, количества адипоцитов) с постепенным формированием отграничивающей соединительнотканной капсулы; пролиферация клеточных элементов реактивно измененной РВСТ с постепенным врастанием в структуру трансплантата и полным его замещение соединительнотканным рубцом Указанные изменения были характерны для обеих групп, однако применение PRP в ранние сроки наблюдения приводило к формированию соединительнотканной капсулы с меньшей толщиной, а также менее выраженной гиперплазией РВСТ меж-адипоцитарных зон . В результате, вплоть до 4 нед . наблюдения выживаемость жирового трансплантата с PRP была большей, чем без PRP Таким образом, PRP может оказать положительное влияние на выживаемость жирового аутотрансплантата, особенно в ранние сроки после операции, однако требуются дополнительные исследования для выбора оптимального протокола обработки ли-пографта PRP и дальнейший анализ причин, механизмов и признаков инволюции трансплантированной жировой ткани

About the authors

I. R Dzampaeva

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

Email: ilonadzampaeva@yahoo.com

I. V Gaivoronskiy

S.M. Kirov Military Medical Academy

I. V Krainik

National Medical Surgical Center

A. Y Drobyshev

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

I. Y Bozo

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry; Human Stem Cells Institute; A.I. Burnazyan Federal Medical Biophysical Center

A. V Glushko

A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry

R. V Deev

Human Stem Cells Institute

References

Supplementary files