Cytokines and growth factors genes expression after subtotal liver resection in rats

Full Text

Введение Регенерации печени млекопитающих после различного рода повреждений посвящено много исследований Большинство работ выполнено на лабораторных грызунах, у которых воспроизведена модель восстановления массы печени после 70% резекции [1]. Значительно меньше работ касается регенерации печени после малой (примерно 30%) и субтотальной (примерно 80%) резекций [2, 3] Несомненно, актуальным является изучение особенностей регенерации печени млекопитающих после резекции разного объема. Однако особенный интерес представляет исследование регенерации печени после субтотальной резекции Это связано с тем, что в онкологии и трансплантологии существует так называемая проблема «малого остатка органа» Пересаживаемая часть донорской печени оказывается слишком малой для поддержания гомеостаза в организме реципиента, что ведет к развитию острой печеночной недостаточности. Подобное состояние развивается и у пациентов, которым произведена достаточно обширная резекция печени в связи с опухолевым процессом [3, 4] Наибольшее значение при регенерации печени после резекции разных объемов отводится экспрессии ряда интерлейкинов (IL-1b, IL-6, IL-10), а также факторов роста (HGF, TGFb, FGF2, TNFa и др ), которые играют ведущую роль в регуляции пролиферации гепатоцитов [5-7]. Данные по экспрессии указанных факторов при регенерации печени после субтотальной резекции противоречивы По данным одних авторов экспрессия IL-1b, IL-6, IL-10, HGF, TGFb, FGF2 и др. после субтотальной резекции повышена на протяжении первых 2-3 сут после операции [8-10], другим авторам удалось зафиксировать только однократное повышение экспрессии того или иного фактора при регенерации печени [4]. Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 62 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В связи с противоречивостью данных об экспрессии тех или иных факторов регенерации после суб-тотальной резекции печени данный вопрос требует дальнейших исследований. Цель работы - изучить динамику экспрессии генов основных сигнальных молекул при регенерации печени после субтотальной резекции у крыс Материал и методы Экспериментальная модель Исследование проводили на самцах крыс (n = 75) аутбредного стока Вистар массой 300-400 г, полученных из питомника Филиала ИБХ РАН (Пущино, Россия). Содержание и использование животных осуществляли в соответствии с Приказом министерства здравоохранения СССР №755 от 12 августа 1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». У подопытных животных производили субтоталь-ную резекцию печени. Крыс наркотизировали диэти-ловым эфиром (МедХимПром, Россия), после чего вскрывали брюшную полость и удаляли срединную, левую боковую и правую верхнюю доли печени (всего 80% общей массы печени), операцию проводили в период с 9 00 до 11 00 ч Животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира через 3, 6, 12, 24, 30, 48 и 72 ч , а также через 5, 7 и 10 сут после резекции печени (5-6 животных на каждый срок). Показателем полноты регенерации печени служило восстановление массы печени, которую оценивали с помощью взвешивания целого органа перед гистологическим исследованием В качестве контроля использовали интактных крыс, одновозрастных с оперированными животными (n = 10). Оценка функции печени Для оценки восстановления функций печени в сыворотке крови подопытных крыс определяли концентрацию альбумина с помощью фотометрического теста с бромкрезоловым зеленым (Albumin DiaS, Диакон-ДС, Россия) и активность аланинамино-трансферазы (АЛТ) фотометрическим тестом (ALAT (GPT Dias), Диакон-ДС, Россия). Забор крови у экспериментальных животных осуществляли под эфирным наркозом пунктированием левого желудочка Гистологическое исследование Для гистологического исследования печень фиксировали в 10% забуференном растворе формалина, после стандартной проводки заливали в парафин, далее готовили срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином Для исследования пролиферации гепатоцитов определяли их митотический индекс, выраженный в промилле (%о). Митозы подсчитывали на гистологических срезах печени, окрашенных гематоксилином и эозином (на 6000 клеток для каждого животного). Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени Экспрессию изучаемых генов определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). При выведении животных из эксперимента кусочки печени массой 30 мг помещали в буфер РНК-лейтер (QiAGEN, Нидерланды), инкубировали в течение 1 сут. при +4°С, хранили при -80°С В качестве индивидуального контроля использовали ткань удаленных долей печени Из полученных образцов выделяли тотальную РНК с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (QiAGEN, Нидерланды). Синтез кДНК с матрицы полученной тотальной РНК осуществляли с использованием готового набора реактивов MMLV RT kit (Евроген, Россия). С полученными кДНК ставили ПЦР, используя готовые наборы реактивов qPCRmix-HS SYBR, содержащих флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green i (Евроген, Россия). Праймеры для ПЦР подбирали с помощью on-line программы PrimerBLAST в соответствии с общепринятыми требованиями Выбранные праймеры (табл ) синтезированы фирмой Евроген (Россия) Таблица. Используемые праймеры Ген 5’-праймер 3’-праймер illb CTGTCT GACCCAT GTGAGCT ACTCCACTT TGGTCTTGACTT il6 TACATATGTTCTCAGGGA GAT GGTAGAAACGGAACTCCAG il10 GCCCAGAAATCAAGGAGCAT TGAGTGTCACGTAGGCTT CTA tnfa CCACCACGCTCTTCTGTCTA GCTACGGGCTTGTCACTCG iNOs CGCTGGTTTGAAACTTCTCAG GGCAAGCCATGTCTGTGAC mmp9 ATGGTTTCTGCCCCAGTGAG CACCAGCGATAACCATCCGA hgf GGCCATGGTGCTACACTCTT TTGTGGGGGTACTGCGAATC tgfb CCGCAACAACGCAATCTATG AGCCCTGTATTCCGTCTCCTT fgf2 CAAGCGGCTCTACTGCAAG GCCGTCCATCTTCCTTCATA vegfa GCAGCGACAAGGCAGACTAT GAGGGAGTGAAGGAGCAACC sdfa CCCTGCCGATTCTTTGAGAG TGGGCTGTTGTGCTTACTTG sox9 AGAGGCCACCGAACAGACT TGCTCAGCTCACCGATGTC tweak GATGGAGCACAGGCAGGTG TGGCTGAGAATTCTTCCAG actß GAGATTACTGCCCTGGCTCC GCTCAGTAACAGTCCGCCTA b2m CTCGCTCGGTGACCGTGAT GGACAGATCTGACATCTCGA gapdh GCGAGATCCCGCTAACATCA CCCTTCCACGATGCCAAAGT Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 63 Для анализа экспрессии генов использовали метод определения порогового цикла (Ct) и вычисления относительной экспрессии гена по методу Pfaffl [11] с учетом рекомендаций Vandesompele [12]. В качестве эндогенного контроля использовали гены домашнего хозяйства actin-ß, b2m, gapdh. Статистический анализ Полученные данные анализировали с использованием программы SigmaStat 3. 5 (SystatSoftwareInc, США). Сравнение двух митотических индексов проводили с помощью z-критерия. Полученные данные об относительной экспрессии сравнивали, применяя U-критерий Манна - Уитни. При сравнении более двух групп использовали ранговый дисперсионный анализ ANOVA on Ranks. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Результаты Выживаемость животных Смертность животных после субтотальной резекции составила примерно 50%, при этом гибель крыс наблюдали только в первые 2 сут после операции, что согласуется с литературными данными [13]. Восстановление массы и функции печени Субтотальная резекция не препятствовала регенерации печени: у выживших животных наблюдали постепенное увеличение массы органа. Через 10 сут. после резекции масса печени у подопытных животных не отличалась от массы печени интактных крыс (p>0,05, рис. 1А). Кроме того, к этому же сроку концентрация альбумина и активность АЛТ в сыворотке крови оперированных крыс не отличались от показателей контрольных животных (p>0,05, рис. 2). Таким образом, можно заключить, что регенерация печени крыс после субтотальной резекции происходит за 10 сут МИ, %0 г 20 -, А 3 сут. 7 сут 10 сут Б Рис. 1. Показатели регенерации печени крыс после субтотальной резекции: А - масса печени крыс после субтотальной гепатэктомии (по оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - масса печени (г); К - масса печени контрольных животных); Б - митотический индекс гепатоцитов (по оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - митотический индекс (%о)); * - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем, p<0,05 г/дл 40 і 35 30 25 20 15 10 5' 0 А Б Е/л 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 il ■ É 3 сут 7 сут 10 сут 3 сут 7 сут 10 сут Рис. 2. Показатели функционального состояния печени: А - концентрация альбумина в сыворотке крови крыс (по оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - концентрация альбумина (г/дл)); Б - активность АЛТ в сыворотке крови крыс (по оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - активность АЛТ (Е/л)); К - показатель животных контрольной группы; * - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем, p<0,05 к к к Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 64 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Митотическая активность гепатоцитов Основным механизмом восстановления массы печени после субтотальной резекции является митотическое размножение гепатоцитов в оставшихся долях печени [13]. Было обнаружено несколько особенностей пролиферации гепатоцитов после суб-тотальной резекции: позднее начало митотической активности и наличие двух пиков митотического индекса (большего через 48-72 ч и меньшего через 7 сут. после операции) (рис. 1Б). Кроме того, несмотря на восстановление массы печени к 10 сут после операции, наблюдались единичные митозы гепатоцитов на этом сроке, что свидетельствует о продолжающемся морфогенезе Динамика экспрессии генов сигнальных молекул При изучении экспрессии генов сигнальных молекул (табл. ) было обнаружено, что в зависимости от реакции на субтотальную резекцию печени все рассматриваемые гены можно разделить на три группы Первая группа объединяет гены, экспрессия которых достоверно повышалась по сравнению с контролем в ранний период (3-48 ч. ) регенерации печени после выполненной операции. К этим генам относятся il6, il10, inos, mmp9, fgf2, tgfb, sox9 (рис. 3). Вторая группа генов, экспрессия которых статистически значимо повышалась на поздних сроках регенерации (5-10 сут. ), включала il1b, tnfa, tweak, inos, hgf (рис 4) В третью группу вошли гены, которые реагировали на субтотальную резекцию достоверным снижением экспрессии в тот или иной период регенерации - ang, vegf, sdfa (рис. 5). Обсуждение Большинство данных о генах, регулирующих регенерацию печени млекопитающих, получено на модели восстановления массы органа после 70% резекции [1, 7]. Последовательность генов, экспрессия которых повышается при регенерации печени, определяется реакцией органа на острую травму и следующей за ней фазой восстановительного процесса [5, 6] Исходя из этого, первой повышается экспрессия про- и антивоспалительных цитокинов, регулирующих вступление гепатоцитов в митотический цикл, а позднее увеличивается экспрессия факторов роста, обеспечивающих прохождение гепатоцитами митотического цикла [5, 6] С этим согласуются наши данные: в первую очередь, через 3-6 ч после операции повышалась экспрессия il6 и il10 (рис. 3). В соответствии с литературными данными зкс-прессия hgf, tgfb и других генов при регенерации печени млекопитающих после частичной гепатэктомии остается повышенной в основном в течение первых 48 ч. [7]. Результаты исследований по субтотальной резекции печени противоречивы В некоторых работах отмечается повышение экспрессии hgf, tgfb, egf и других генов только в течение первых 2-3 сут регенерации печени [4]. В ряде других исследований отмечается повышенная экспрессия генов на протяжении всего периода регенерации печени, вплоть до 14 сут. после операции [8-10]. Однако в нашей работе были обнаружены две фазы повышенной экспрессии генов: ранняя фаза - в течение 3-48 ч после резекции, и поздняя - в течение 5-10 сут Видимо, наличие двух фаз повышенной экспрессии генов при регенерации печени крыс после субтотальной резекции связано с двумя волнами пролиферации гепатоцитов Различия в наборе генов, экспрессия которых повышается в раннюю или позднюю фазы регенерации, определяются, на наш взгляд, несколькими причинами Во-первых, для раннего периода регенерации печени характерно повышение экспрессии генов острой фазы (il1b, il6, 1l10), и тесно связанного с ними - mmp9 [1, 7], что согласуется с нашими данными Кроме того, на временную динамику экспрессии генов будет оказывать влияние наличие запаса фактора роста в печени, который высвобождается во время регенерации В таком случае экспрессия гена данного фактора будет повышаться только после истощения депо, что характерно для HGF, который является главным митогеном гепатоцитов при регенерации печени [1, 7]. Если же запасы фактора роста в самой печени невелики, то следует ожидать активации экспрессии гена уже на раннем этапе восстановления печени Вероятно, этим объясняется динамика экспрессии tgfb, который кодирует фактор роста, останавливающий регенерацию печени, а также fgf2, являющегося слабым митогеном для гепатоцитов и эндотелиоцитов [1, 7]. Также в раннем периоде регенерации печени повышается экспрессия генов острой фазы, кодирующих синтез недепонируемых факторов. Кроме того, на динамику экспрессии генов клеток печени при ее регенерации может оказывать влияние то, что многие факторы роста, регулирующие этот процесс, синтезируются в других органах Так, показано, что после 70% резекции печени hgf начинает активно экспрессироваться не только в клетках регенерирующего органа, но еще и легких, почках и селезенке [14, 15]. Видимо, с этим связано то, что мы не обнаружили повышенной экспрессии hgf в печени после субтотальной резекции на ранней стадии регенерации Стоит также обратить внимание на то, что среди генов, чья экспрессия, как мы установили, повышалась после субтотальной резекции печени у крыс, большинство являются генами макрофагов: il1b, il6, il10, inos, tnfa, tweak, что указывает на ключевую роль данной популяции клеток в координации регенерации печени [6] В соответствии с литературными данными TNFa и IL6 образуют регуляторную систему, которая стимулирует в гепатоците экспрессию так называемых генов раннего ответа, что приводит к вступлению клетки в митотический цикл [5, 6]. Помимо прочего, показано, что TNFa/IL6 стимулируют образование iNOS, которая вместе с NO защищает гепатоциты от высокого уровня TNFa/IL6 [16]. Кроме того, в настоящее время появились данные о том, что IL6 индуцирует синтез HGF, который, помимо стимуляции пролиферации эпителиальных клеток и подавления апоптоза, вместе с IL10, оказывает противовоспалительный эффект [17]. FGF2, так же, как и HGF, обладает широким спектром эффектов: стимулирует пролиферацию, ангиогенез и др. Взаимодействие провоспалительных цитокинов и FGF2 активно изучается. Так, показано, что М2 макрофаги способны индуцировать в тканях экспрессию fgf2 [18]. Кроме того, установлено, что IL1b стимулирует синтез и высвобождение FGF2 из эндотелиоцитов [19]. Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 65 4,0( 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1,00 0,50 0,00 А iü ■ - àà. 12,00 10,00 3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. 4,00 0,00 Б я к * і I : I л _ Г*І й J 1 , гТі_ 3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. 7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1,00 0,00 В 2,50 1ы II« 1,00 0,50 0,00 J І к ri Д 3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. 3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. Д Е 3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 5 сут. 7 сут. 10 сут. 3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. Ж і Ti т AL ■ 3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. Рис. 3. Гены, экспрессия которых повышалась через 3-48 ч. после субтотальной резекции печени: А - экспрессия гена il6; Б - экспрессия гена il10; В - экспрессия гена iNOs; Г - экспрессия гена mmp9; Д - экспрессия гена fgf2; Е - экспрессия гена tgfb; Ж - экспрессия гена sox9. Белые столбцы - показатели контрольной группы; серые столбцы - показатели экспериментальной группы. По оси абсцисс - время после операции, по оси ординат - относительная экспрессия в условных единицах (у. е. ). * - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем, p<0,05 Г Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 66 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ А Б 5.00 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1,00 0,50 0,00 fu ■ il 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. В I 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. Рис. 4. Гены, экспрессия которых повышалась через 5-10 ч. после субтотальной резекции печени: А - экспрессия гена il1b; Б - экспрессия гена tnf-a; В - экспрессия гена hgf; Г - экспрессия гена tweak. Белые столбцы - показатели контрольной группы; серые столбцы - показатели экспериментальной группы. По оси абсцисс - срок после операции, по оси ординат - относительная экспрессия в условных единицах (у. е. ). * - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем, p<0,05 А І fk fil і I il 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1,00 0,50 0,00 Б * * * IMl 111 m 3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. 3 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. В І І І її, Рис. 5. Гены, которые реагировали на субтотальную резекцию печени только снижением экспрессии: А - экспрессия гена ang; Б - экспрессия гена vegf; В - экспрессия гена sdfa. Белые столбцы - показатели контрольной группы; серые столбцы - показатели экспериментальной группы. По оси абсцисс - срок после операции, по оси ординат - относительная экспрессия в условных единицах (у. е. ). * - различия статистически значимы по сравнению с соответствующим контролем, p<0,05 6 ч. 12 ч. 24 ч. 30 ч. 48 ч. 3 сут. 5 сут. 7 сут. 10 сут. 3 ч 3 ч 3 ч 3 ч Гены & Клетки Том XI, № 1, 2016 оригинальные исследования 67 Роль в регенерации печени IL1b и IL10 в настоящее время активно изучается . Показано, что данные цитокины подавляют пролиферацию гепатоцитов и, таким образом, вместе с TGFb приводят к завершению восстановительных процессов в печени [20]. Также обращает на себя внимание обнаруженная нами повышенная экспрессия sox9 и tweak, что косвенно указывает на возможное участие резидентных стволовых клеток в регенерации печени крыс после субтотальной резекции. SOX9 является транскрипционным фактором, который участвует в гистогенезе многих тканей млекопитающих [21]. В настоящее время SOX9 рассматривают как маркер резидентных прогениторных клеток печени [21, 22]. TWEAK относится к семейству белков TNF и, как показано, играет определенную роль в регуляции пролиферации гепатоцитов при регенерации печени . Кроме того, считают, что TWEAK посредством его рецептора fn14 участвует в регуляции активности резидентных прогениторных клеток печени [22]. Помимо генов с повышенной экспрессией мы обнаружили, что vegf, sdfa, ang на всем протяжении регенерационного процесса экспрессировались в оперированной печени на более низком уровне, чем у интактных животных (рис . 5) . VEGF и ангиогенин стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов в ходе регенерации печени [23], а SDFa вызывает миграцию клеток красного костного мозга в печень при различного рода повреждениях [24]. Возможно, снижение экспрессии генов указанных факторов в печени происходит за счет повышенного их синтеза в других органах, а также за счет того, что активно экспрессирующиеся факторы роста при данном виде повреждения берут на себя роль других факторов роста Большинство изученных генов, в том числе и те, у которых удалось обнаружить повышенную экспрессию, на некоторых сроках после операции экспрессировались с меньшей активностью по сравнению с контролем . Так, мы обнаружили сниженную экспрес сию tweak в период 6-24 ч . , tnfa через 3 и 12 ч . , tgfb и il1b через 12 ч . , hgf через 24, 48 и 72 ч . На раннем этапе регенерации это, видимо, объясняется стрессовой реакцией печени на тяжелую травму, а на стадиях, следующих после повышенной экспрессии того или иного гена, разрушением большого количества мРНК с помощью микроРНК [25] Заключение Таким образом, в ходе выполненной нами работы был установлен ряд особенностей регенерации печени крыс после субтотальной резекции В первую очередь это касается динамики пролиферации гепатоцитов, где было обнаружено два пика митотической активности, при этом первый пик приходился на ранний период регенерации (48-72 ч . ), а второй - на поздний (7 сут . ) . Также были выявлены особенности экспрессии некоторых ключевых генов регенерации печени после субтотальной резекции Было обнаружено две фазы повышенной экспрессии генов, которые соответствуют первому и второму пикам пролиферации гепатоцитов Каждая фаза различается набором генов с повышенной экспрессией . Для первой фазы характерно повышение экспрессии mmp9, il6, il10, fgf2, tgfb. Во вторую фазу была повышена экспрессия hgf, tnfa, tweak, il1b. Кроме того, после субтотальной резекции было выявлено повышение экспрессии гена фактора транскрипции SOX9, а также гена, кодирующего TWEAK, что указывает на возможную роль резидентных прогениторных клеток в регенерации печени крыс после такой травмы .

About the authors

A. V Elchaninov

Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology; Scientific Research Institute of Human Morphology; N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

T. Kh Fatkhudinov

Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology; Scientific Research Institute of Human Morphology; N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: fatkhudinov@gmail.com

N. Y Usman

Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology; Scientific Research Institute of Human Morphology; N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

I. V Arutyunyan

Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology; Scientific Research Institute of Human Morphology; N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

A. V Makarov

Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology; Scientific Research Institute of Human Morphology; N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

E. Y Kananykhina

Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology; Scientific Research Institute of Human Morphology

E. Sh Raimova

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

G. B Bolshakova

Scientific Research Institute of Human Morphology

G. T Sukhikh

Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

References

Supplementary files