The eperience in development and implementation of hereditary diseases genetic diagnosis based on DNA microarrays

Abstract

Full Text

В настоящее время по оценкам экспертов ВОЗ средняя частота моногенных наследственных заболеваний в мире составляет 10 случаев на 1000 новорожденных. При этом каждый фенотипически здоровый человек является носителем по меньшей мере 5-7 патологических мутаций, которые могут привести к развитию одного из 8000 известных наследственных заболеваний. Эффективная терапия разработана на сегодняшний день лишь для 50 из них, а тяжелое течение и высокий риск возникновения повторных случаев моногенной патологии делает чрезвычайно актуальной разработку профилактических мероприятий, как в отягощенных семьях, так и для всех пар, планирующих деторождение. Наиболее эффективным способом профилактики является преконцепционный и неонатальный молекулярно-генетический скрининг как наследственных заболеваний, так и их носительства. Однако, данный метод на сегодняшний день все еще остается достаточно дорогим и трудоемким. Вследствие этого в клинической практике имеется существенный запрос на создание и внедрение новых методов быстрого, точного и недорогого выявления наследственной патологии. В связи с этим основной целью представляемой работы было создание высокопроизводительного, дешевого и достоверного диагностикума для выявления наиболее распространенных на территории России мутаций, связанных с наследственными заболеваниями. В качестве базовой была выбрана технология элонгации праймеров на микроматрице (англ. APEX - arrayed primer extension), сочетающая реакцию ПЦР и технологию ДНК-микроматриц. В диагностикум было заложено 284 мутации, ассоциированные в общей сложности с 66 наследственными моногенными заболеваниями и предрасположенностью к 6 мультифакторным заболеваниям. В рамках разработки был произведен отбор мутаций и полиморфизмов, которые должны детектироваться с использованием ДНК-микрочипа, а также проведены его техническая и клиническая валидация. В рамках технической валидации были отобраны 13 пациентов с известным генотипом по одному из генетических маркеров, входящих в диагностикум. В результате были получены предварительные данные о воспроизводимости и достоверности результатов генотипирования, осуществленного с использованием набора. Клиническая валидация диагностикума проходила в два этапа, в рамках которых были определены его специфичность и чувствительность. На первом этапе было осуществлено генотипирование образцов синтетической ДНК, содержащих все вошедшие в ДНК-микрочип генетические маркеры во всех трех состояниях (дикий тип, гетерозигота, мутантная гомозигота). В качестве референсного метода определения последовательности использовалось секвенирование по Сэнгеру. Результаты генотипи-рования отдельных точек, полученные различными методами, были проанализированы и сопоставлены. Специфичность ДНК-микрочипа составила 98%, а чувствительность 96%. На втором этапе с использованием ДНК-микрочипа было проанализировано 10 образцов геномной ДНК с известным генотипом хотя бы по одному генетическому маркеру. В качестве референсного метода определения последовательности использовался метод MLPA. Результаты генотипи-рования отдельных точек, полученные различными методами, были проанализированы и сопоставлены. Специфичность диагностикума по результатам второй фазы клинической валидации составила 98%. Полученные данные позволили запустить использование разработанного ДНК-микрочипа в качестве скринингового метода для профилактики наследственных заболеваний. Таким образом, нами был разработан уникальный молекулярно-генетический диагностикум, сфокусированный на популяции, проживающие на территории России, с известными рабочими характеристиками.