Transplantation of hepatic stellate, genetically modified genes hgf and fgf4, stimulates differentiation of hepatocytes in rats after partial hepatectomy

Full Text

Введение Хронические заболевания печени различной этиологии остаются проблемой современной медицины Многие годы смертность от заболеваний печени входит в первую десятку среди всех причин смерти и лидирует по этому показателю в гастроэнтерологии [1]. В настоящее время ведется активный поиск новых методов лечения этих заболеваний с применением стволовых клеток и при помощи генно-клеточной терапии Существует широкий спектр различных стволовых клеток, которые потенциально могут быть использованы для клеточной терапии заболеваний печени [2-4]. Одним из видов клеток, рассматриваемых в качестве прогениторных клеток печени, являются звёздчатые клетки печени (ЗКП). Научной группой кордеса эти клетки были отнесены к резидентным мезенхимным стволовым клеткам печени, которые вносят свой вклад в регенерацию и фиброгенез в органе [5]. Ранее в наших исследованиях было показано, что после трансплантации звёздчатых клеток печени крысам с различными повреждениями печени происходит их дифферен-цировка в клетки с фенотипом гепатоцитов [6-9]. Однако количество таких клеток было небольшим, что может оказаться недостаточным при необходимости быстрого восстановления функционального потенциала печени В поисках решения этой проблемы большую актуальность приобретает разработка методов клеточной терапии с использованием генетической модификации стволовых клеток. Генно-клеточная терапия ориентирована на придание клеткам новых функций Так, для генно-клеточной терапии заболеваний печени перспективным может стать использование таких ключевых для дифферен-цировки клеток печени факторов роста, как фактор роста гепатоцитов (Hepatocyte Growth Factor, HGF) и фактор роста фибробластов 4 (Fibroblast Growth Factor 4, FGF4). HGF - это гликопротеин, являющийся сильным митогеном для гепатоцитов и участвующий в регенерации печени, он стимулирует пролиферацию некоторых типов эпителиоцитов, а также эндотелиальных клеток и меланоцитов [10]. Фактор роста фибробластов 4 стимулирует деление различных клеток мезенхимного происхождения [11]. Исходя из этого в настоящей работе было изучено влияние трансдукции ЗКП генами этих факторов на их регенераторный потенциал после трансплантации крысам, перенесшим частичную гепатэктомию (ЧГ). Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 100 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и методы Работа выполнена на модели частичной гепатэк-томии (ЧГ) по методике Хиггенса и Андерсона [12]. Удалением 68% массы печени достигалась стимуляция регенераторного ответа в сохранившихся долях Метод поддается хорошей стандартизации и является классической моделью для изучения регенерации печени. В исследовании были использованы самцы крыс породы Вистар массой 250-300 г. Животные находились на стандартном рационе вивария и имели свободный доступ к воде. Экспериментальных животных разделили на 3 группы: 1 группа (контрольная) - крысы, перенесшие ЧГ с введением физиологического раствора; 2 группа - крысы, перенесшие ЧГ с трансплантацией ЗКП, трансдуци-рованных трейсерным геном красного флуоресцентного белка (Red Fluorescent Protein, RFP); 3 группа - крысы, перенесшие ЧГ с трансплантацией ЗКП, трансдуцированных генами rfp, hgf и fgf4. Выделение ЗКП было проведено методом кол-лагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза [6] Количество выделенных клеток и их жизнеспособность определяли путём подсчёта клеток в камере Горяева при разведении клеточной суспензии в трипановом синем в соотношении 1:10. ЗКП трансдуцировали аденовирусным вектором, несущим гены rfp, hgf и fgf4, культивировали в инкубаторе в течение одного часа при температуре 37°С и 5% содержания СО2 во влажной атмосфере в питательной среде DMEM (Sigma, США), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Sigma, США), 146 мг/мл L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США). Трансплантацию ЗКП проводили интраопераци-онно путём введения суспензии клеток в воротную вену в дозе 3х106 кл./животное. Животных выводили из эксперимента через 1, 2, 3, 5, 7, 14, 28 сут. после введения клеток, кусочки печени помещали в 10% нейтральный забуференный формалин на 0,2 М фосфатном буфере (pH = 7,4) на 24 ч для фиксации, далее заливали в парафин по стандартной методике. Срезы окрашивали иммуногистохимически с коммерческими поликлональными антителами к RFP (GenScript, США, 1:400), HGF (Abcam, Англия, 1:200), FGF4 (Abcam, Англия, 1:1000), маркёру ге-патобластов a-фетопротеину (a-ФП, Abcam, Англия, 1:200), маркёру стволовых и прогениторных клеток С-kit (рецептор к фактору стволовых клеток, Abcam, Англия, 1:400). Иммуногистохимическое окрашивание было проведено с использованием визуализа-ционных систем Novolink (Novocastra, Англия), CSA и Envision (Dako, Дания). Контроль специфичности иммуногистохимической реакции проводили путём замены первичных антител неиммунной сывороткой мыши или кролика, а также путём исключения из реакции первичных антител Результаты и обсуждение В первой группе (контроль) ни на одном из сроков не были обнаружены RFP-позитивные клетки. Экспрессия HGF и FGF4 была выражена слабо На протяжении всего эксперимента в печени около сосудов были обнаружены единичные слабо позитивные по этим белкам округлые клетки. На вторые сутки после операции были обнаружены HGF позитивные ге-патоциты (рис. 1А) и на этом же сроке значительно увеличилось количество FGF4-позитивных клеток (рис. 1Б). Начиная с третьих суток позитивное окрашивание наблюдали только в единичных округлых клетках около сосудов Во второй группе уже через сутки после трансплантации свежевыделенных ЗКП, трансдуцированных трейсерным геном, в печени крыс появлялись RFP+ клетки, идентичные по размерам и форме гепатоцитам (рис. 1В). Клетки располагались как изолированно, так и группами по 3-5-7 клеток. Расположение многих клеток группами может свидетельствовать о пролиферации клеток, дифференцирующихся из одной клетки предшественника Экспрессии HGF и FGF4 не было обнаружено ни на одном экспериментальном сроке В третьей группе уже через сутки после трансплантации ЗКП, трансдуцированных терапевтическими генами, крысам, перенесшим ЧГ, в печени крыс реципиентов появлялись многочисленные небольшие округлые RFP+ клетки в портальных трактах (в среднем 8-10 кл./портальный тракт), а также довольно многочисленные гепатоциты, экспрессирующие этот белок (рис 2А) Последние располагались главным образом перипортально, по одному или группами по 2-3 клетки, а также тяжами вдоль оси ацинуса. Ещё через сутки число позитивных гепатоцитов возрастало до 20-25/портальный тракт (рис. 2Б), многие позитивные гепатоциты имели два ядра На сроке 3 сут. число RFP+ гепатоцитов немного снижалось, а к 5 суткам вновь возрастало и достигало максимума - одиночные и сгруппированные клетки, Рис. 1. Печень крысы через двое суток (А, Б, 1 группа) и через одни сутки (В, 2 группа) после ЧГ: А - HGF+ гепатоциты, Б - FGF4+ клетки в синусоидах, В - RFP+ гепатоциты. Продукт иммуногистохимической реакции красного цвета, ядра докрашены гематоксилином. Ув.: А, Б х200; В х100 Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 101 тяжи клеток преимущественно в портальных зонах После 7 сут. число позитивных гепатоцитов постепенно снижалось, и на сроке 28 сут. можно было видеть только единичные (1-3 кл./поле зрения) округлые клетки в паренхиме печени. На ранних сроках (1-2 сут. после операции) HGF экспрессировали лишь мелкие округлые клетки, с третьих суток появлялись также HGF+ гепатоциты, а через 28 сут. можно было видеть многочисленные гепатоциты, экспрессирующие HGF (рис. 2В). FGF4 появлялся через сутки в единичных мелких округлых клетках, через 2 сут. - в гепатоцитах (1-2 кл./поле зрения), ещё через сутки число позитивных гепатоцитов возрастало до 4-5 в поле зрения (рис. 2Г), а затем снижалось, и до конца эксперимента FGF4 выявлялся в единичных округлых клетках и гепатоцитах Таким образом, в 3 экспериментальной группе ре-популирующий эффект от трансплантации ЗКП оказался существенно выше и продолжительнее, чем в контроле (группа 1) и в группе 2 (ЧГ с трансплантацией ЗКП, трансдуцированных трейсерным геном), что подтверждает эффективность выбранных генов для ускорения восстановления гепатоцитов после повреждения и увеличения их количества Изучение динамики количества дифференцирующихся гепатоцитов (а-ФП+ гепатобластов) также указывает на стимулирующий эффект на регенерацию печени трансплантации ЗКП, трансдуциро-ванных терапевтическими генами В первой группе окрашивание с антителами к a-ФП показало наличие дифференцирующихся а-ФП+ гепатоцитов через 2 сут. эксперимента (рис. 3А), на более поздних сроках такие клетки отсутствовали, а затем появлялись вновь через 14 сут после ЧГ Этот факт позволяет предположить, что в ходе регенерации печени после ЧГ дифференцировка гепатоцитов происходит волнообразно: первая волна наблюдается в первые дни, а вторая начинается в конце второй недели после операции Данный феномен установлен нами впервые и требует дополнительного изучения Анализ количества а-ФП+ гепатобластов во второй группе показал, что в первые сутки после трансплантации появляются единичные гепатобласты, экспрессирующие a-ФП, с 3 по 7 сут. их число уменьшается, при этом на 5 сут. наблюдается максимальное количество синусоидных клеток, экспрессирующих a-ФП (рис. 3Б). На более поздних сроках, как и в начале эксперимента, можно было видеть только единичные а-ФП+ гепатобласты. Таким образом, экспрессия a-ФП в этой группе была более выраженной и постоянной, чем в контроле Этот факт позволяет сделать вывод, что трансплантация клеток стимулирует дифференцировку прогениторных клеток печени в гепатоциты. Кроме того, учитывая появление в печени реципиентов RFP + клеток, имеющих форму и размеры гепатоцитов, можно предположить, что введенные ЗКП также могут способствовать диффе-ренцировке в гепатоциты В третьей группе окрашивание с антителами к a-ФП показало, что количество дифференцирующихся гепатоцитов (гепатобластов) в первые сутки было небольшим (единичные a-ФП-позитивные клетки), ещё через сутки оно значительно возрастало, множество a-ФП+ гепатобластов было диффузно распределено в паренхиме печени, затем число таких клеток несколько снижалось Однако начиная с 14 сут. и до конца эксперимента (28 сут. ) мы наблюдали резкое возрастание числа a-ФП+ ге-патобластов, когда наряду с отдельными клетками появлялись группы и тяжи гепатобластов, экспрессирующих a-ФП (рис. 3В). Интересно, что в этой группе на тех же сроках значительная часть гепа-тоцитов экспрессировала маркёр стволовых клеток C-kit (рис. 3Г). Вероятно, и в этом случае мы наблюдали две волны регенерации гепатоцитов, как это было выявлено в контроле, однако в данном случае дифференцировка гепатобластов носила более массовый характер и была более продолжительной, что, по-видимому, отражает влияние терапевтических генов на данный процесс Появление C-kit+ клеток указывает на активацию стволового компартмента и подтверждает полученные нами ранее данные об активации региональных стволовых клеток печени после ЧГ и их участии в регенерации [13, 14]. Рис. 2. Печень крысы через одни (А), двое (Б) и трое (В, Г) суток после ЧГ и трансплантации RFP+/HGF+/FGF4+ ЗКП (3 группа): А, Б - RFP+ гепатоциты; В - HGF+ гепатоциты; Г - FGF4+ гепатоциты. Продукт иммуногистохимической реакции красного цвета, ядра докрашены гематоксилином. Ув. х400 Гены & Клетки Том X, № 4, 2015 102 оригинальные исследования ?rænxï г^-гжт Г-.. Л £ґ< иї**2? •• -Э^:* feetfàtâr й?вЯ5.1й Рис. 3. Печень крысы через одни (А), пять (Б), четырнадцать (Г), двадцать восемь (В) сут. после ЧГ: А - 1 группа; Б - 2 группа; В - 3 группа, а-ФП+ гепатоциты и синусоидные клетки; Г - 3 группа, C-kit+ гепатоциты. Продукт реакции красного цвета, ядра докрашены гематоксилином. Ув.: А, Б х400, В, Г х200 Полученные результаты показали, что трансплантация ЗКП повышает активность и скорость регенерации печени после ЧГ Также установлено, что введение в ЗКП ещё двух генов, HGF и FGF4, облегчает приживление клеток и их дифференцировку в гепа-тоцитарном направлении, что подтверждается большим числом гепатоцитов, экспрессирующих трей-серный ген RFP, а также большим числом а-ФП + гепатобластов по сравнению с экспериментальной группой, в которой животным водили ЗКП, транс-дуцированные только трейсерным геном GFP. Таким образом, представленная комбинация генов может рассматриваться как потенциально эффективная для стимуляции регенерации печени и восстановления популяции гепатоцитов и перспективная для разработки методов генно-клеточной терапии заболеваний печени Благодарности Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований 12-04-97088-р_поволжье_а «Изучение фундаментальных механизмов пластичности и направленной дифференцировки звёздчатых клеток печени для разработки клеточной биомедицинской технологии восстановления гепатоцитов».

About the authors

A. A Titova

Kazan (Volga region) Federal University

Email: anjerika@list.ru

E. I Sharipova

Kazan (Volga region) Federal University; Kazan State Medical University

G. O Pevnev

Kazan (Volga region) Federal University; Kazan State Medical University

M. O Mavlikeev

Kazan (Volga region) Federal University; Kazan State Medical University

A. K Shafigullina

Kazan (Volga region) Federal University

G. R Burganova

Kazan (Volga region) Federal University

M. A Titova

Kazan (Volga region) Federal University

A. A Rizvanov

Kazan (Volga region) Federal University

A. A Gumerova

Kazan (Volga region) Federal University

A. P Kiyasov

Kazan (Volga region) Federal University

References

Supplementary files