Immunogenicity of plasmid vector co-expressing recombinant proteins using foot-and-mouth disease virus 2A-peptides

Abstract

Full Text

Приоритетным направлением генно-клеточной терапии является поиск оптимального вектора - переносчика генетической информации. Идеальная векторная система биобезопасна, бесконтрольно не интегрируется в геном, обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантых белков в системах in vivo и in vitro. Помимо экспрессии целевых генов широко применяется экспрессия репортерных генов (флуоресцентные белки, маркеры антибиотикоустойчивости), облегчающих идентификацию модифицированных клеток и позволяющих визуально оценить эффективность трансфекции. В качестве терапевтических агентов выступают гены, кодирующие различные ферменты, факторы роста и молекулы адгезии, повышающие жизнеспособность клеток, модулирующие тропизм и способность к дифференцировке в определенном направлении. Зачастую для достижения максимального терапевтического эффекта необходимо экспрессировать комбинацию терапевтических генов. Таким образом, возникает вопрос об использовании эффективной стратегии ко-экспрессии ряда белков с минимальными затратами энергии. В 1988 г. двумя независимыми группами ученых - Пеллетье и Соненберга, и Джанга, было показано, что внутренний участок встраивания рибосомы (IRES), первоначально обнаруженный у вирусов эукариот, инициирует связывание с рибосомой и трансляцию по кэп-зависимому механизму (Pelletier, Sonenberg, 1988). С того времени в системах in vitro и in vivo стали широко использовать бицистронные векторы, в которых трансляция основного полипептида с мРНК первичного транскрипта является кэп-зависимой, а второго - IRES-зависимой. Такие векторы широко используются в генно-клеточной терапии, где один из генов представлен селективным маркером или геном, кодирующим репортерный белок, а второй - целевой. Однако значительный размер IRES-элементов и низкая эффективность инициации трансляции второго полипептида значительно ограничивают их применимость в генной терапии (Chan H.Y. et al., 2011). Перспективной альтернативой IRES стали векторы, содержащие 2А- пептидные последовательности вируса ящура. Малый размер 2А-пептидного участка (14±20 аминокислот) и способность к саморасщеплению на С-конце без реинициации трансляции позволяет осуществлять синтез нескольких полипептидов с одного транскрипта мРНК и весьма привлекательны для генотерапевтических приложений. Эквимолярная экспрессия всех белков в рамках одной векторной системы, а также небольшой размер пептида, являются очевидными преимуществами по сравнению с IRES. Недостатками такой системы могут стать иммунологические реакции на вирусные пептиды, а также особенности посттрансляционного фолдинга белков (Ryan et al., 1991). Целью работы стала оценка иммуногенных свойств 2А-пептидного генотерапевтического препарата в системе in vivo. В качестве генопрепарата выступила рекомбинантная плазмида pVEGF-FuP2A-FGF2-FuP2A-EGFP, кодирующая гены сосудистого эндотелиального фактора роста, основного фактора роста фибробластов и зеленого флуоресцентного белка, соединенных в единую открытую рамку считывания при помощи 2А-пептидных последовательностей. Плазмиды представляют собой наиболее биобезопасные генетические векторы - они обладают малой иммуногенностью и не способны к интеграции в геном клетки-мишени, что определяет их онкологическую безопасность. Однако, несмотря на перечисленные достоинства, плазмидным векторам присущ ряд недостатков, таких как низкая эффективность трансфекции клеток и кратковременная экспрессия трансгенов. Возможность одновременной экспрессии нескольких терапевтических генов позволит частично нивелировать низкую эффективность трансфекции. Препарат вводили самцам мышей в возрасте 3 месяцев. Было произведено введение «голой» плаз-мидной ДНК, а также в присутствии катионного транс-фекционного препарата TurboFect in vivo (Fermentas, Канада). Через 28 сут. осуществлялся забор крови из хвостовой вены с последующим получением сыворотки. Выявление антител к чужеродным антигенам проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием очищенных рекомбинантных белков VEGF и FGF2 человека, а также синтетического 2А-пептида CGDVEENPG. Наиболее сильный иммунный ответ на чужеродный пептид был зарегистрирован через 48 дней после повторного введения препарата с использованием трансфицирующего реагента. Также были выявлены антитела на рекомбинантные антигены: сосудистый эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов, что подтверждает экспрессию рекомбинантных белков в системе in vivo.