Modeling of interneuronal syncytial connection in vitro

Abstract

Full Text

Обнаруженная недавно возможность нейроногенеза из камбиальных малодифференцированных клеток головного мозга взрослых не нарушает твердо установленный факт неспособности высокодифференцированных нейронов делиться. Многочисленные исследования свидетельствуют о возможностях нервных клеток так же, как и других, формировать дву- и многоядерные комплексы, включая гибридные гетерокарионы. Механизмом этого процесса может являться только синцитиальное слияние клеток. До недавнего времени нейрональная доктрина исключала само существование синцитиальной связи в нервной системе. Основным доказательством явилось открытие химических синапсов с помощью электронного микроскопа. Существенные дополнения и видоизменения нейронной теории требуют обнаружение высокопроницаемых мембранных щелевых контактов, сочетающих электротоническую передачу сигнала и наноскопическую межклеточную цитоплазматическую диффузию, а также плотных контактов, метастабильных по своей сути состояний мембран, которые могут приводить к более протяженным трансмембранным перфорациям, обеспечивающим синцитиальную связь контактирующих клеток. С целью доказательства существования синцитиальной цитоплазматической связи в нервной системе была разработана модель синцитиальной связи нейронов in vitro, приоритет которой был подтвержден патентным свидетельством № 2433484. Материалом служили нейроны из ганглиев моллюска Lymnaea stagnalis, экспериментальное синцитиальное слияние которых добивались без специальных химических реагентов, таких как полиэтиленгликоль, латекса полистирола и пр., без электропорации, электроакустического воздействий и повышения температуры, что является травмирующими агентами для живых клеток. Предложенный способ моделирования синцитиальной связи нейронов in vitro заключается в диссоциации нервных клеток, освобождении их от соединительной капсулы ганглия и глиальных оболочек общеизвестным протеолитическим способом, помещениеи их в культуральную среду, центрифугировании и инкубации в питательной среде в течение последующих 2-х сут. Далее конгломераты клеток фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом и 1% осмием с последующей дегидратацией этиловым спиртом восходящей концентрации. Заливали в смесь аралдитов по стандартной прописи для электронно-микроскопического исследования. С помощью светового фазово-контрастного микроскопа на полутонких срезах обнаруживали цитоплазматические «ножки» нейронов, соединяющие соседние клетки. В конгломератах насчитывали от 2±3 до 5±7 сцепленных между собой нейронов. На ультраструктурном уровне регистрировали фрагментацию клеточных мембран в области соприкосновения «ножек», образование сквозных межмембранных перфораций, соединяющих цитоплазму соседних клеток. Вблизи таких участков нередки митохондрии, а вдоль сохранившихся мембран, имеющих иногда признаки септальных специализаций, встречались субмембранные цистерны эндоплазматического ретикулума. Наблюдения показывают, что при такой обработке нейронов, они сохраняют свою жизнеспособность, восстанавливают естественную способность к агрегации и адгезии, а лишившись глиальной изоляции, контактируют с образованием синцитиальной связи, что в дальнейшем могло бы привести, на наш взгляд, к полной редукции межклеточных участков мембран и слиянию соседних нейронов. Таким образом, предложенная технология межнейронных взаимодействий дает возможность изучать прямые контакты клеток и моделирует образование нейронального синцития в условиях in vitro. Это принципиально важно, ибо доказывает, что в нервной системе между нейронами помимо химических синапсов и электропроницаемых контактов су ществует третий тип коммуникаций - синцитиальная цитоплазматическая связь. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ: № 09-01-00473, № 10-04-90000- Bel_a.