Influence of cleaning cryoprotectant DMSO of material for transplatation on properties of hematopoietic stem cells

Abstract

Full Text

Актуальность. Побочные эффекты, возникающие во время введения трансплантационного материала, содержащего гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), по механизмам возникновения разделяют на три основные группы: эффекты, которые возникают вследствие раздражения блуждающего нерва при трансфузии холодного трансплантационного материала; эффекты, связанные с цитолизом клеток трансплантационного материала вследствие криоповреждения при хранении; эффекты, связанные с наличием в трансплантационном материале криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО). Для предотвращения побочных эффектов, связанных с введением пациенту ДМСО с трансплантационным материалом, после размораживания материала производят его отмывание от криопротектора. Один из вариантов данного метода предполагает многократное разведение размороженного материала аутоплазмой с последующим фракционированием и плазмоэкстракцией. Кроме того, в практике применяют автоматизированное отмывание криопротектора. Некоторые исследователи утверждают, что по данным проточной цитометрии, влияние данных манипуляций на жизнеспособность ГСК не значимо. Следует отметить, что проточная цитометрия не позволяет в полной мере оценить способность ГСК к восстановлению кроветворения. С учетом сказанного выше нами было выполнено стендовое исследование влияния отмывания ДМСО на репродуктивные свойства ГСК трансплантационного материала. Материал и методы. В качестве материала для исследования был использован концентрат монону-клеаров пуповинной крови (ПК), полученной в ходе естественных родов. Полученный материал был подготовлен к замораживанию путем добавления криопротектора ДМСО в конечной концентрации 7,5%. Далее материал подвергали замораживанию и хранению в жидком азоте. Размораживание материала выполнялось на водяной бане при +40°С в течение 1-2 мин. Сразу после размораживания производился отбор пробы для лабораторного анализа. Далее из криопакета с биоматериалом в стерильных условиях отбирали 2 мл пробы в центрифужную пробирку на 15 мл. Добавлением к образцу раствора RPMI доводили объем до 10 мл. Таким образом, получали пятикратное разведение пробы, а концентрация ДМСО снижалась до 1,5%. Затем пробирку с пробой центрифугировали при 600 оборотах в минуту в течение 20 минут. После центрифугирования 8 мл образовавшегося супернатанта, не содержащего клетки, удаляли. К оставшейся суспензии клеток снова добавляли RPMI доводя объем клеточной взвеси до 10 мл. Таким образом, получали в материале концентрацию ДМСО 0,3%. Снова центрифугировали и снимали супернатант. Полученную суспензию клеток тщательно перемешивали и выполняли исследование количества ГСК и их способности к кроветворению. Количество ГСК определяли на проточном цитометре CYTOMICS FC 500, с использованием набора реагентов Stem-Kit Reagents. Для изучения колониеобразующей активности ГСК была использована готовая метилцеллюлозная среда MethoCultH4434 Classic, содержащая факторы роста. Подсчет колоний проводился на 14 день культивирования. Результаты и обсуждение. При исследовании влияния отмывания подвергнутого криохранению и размороженного концентрата ГСК ПК от ДМСО, было выявлено снижение количества ГСК на 18%±8 и статистически достоверное снижение колониеобразующей активности ГСК на 45%±11 (p<0,05). Изменения, происходящие с концентратом ГСК, подвергнутым криохранению и размораживанию, необходимо учитывать при проведении трансплантации и принятии решения о целесообразности отмывания трансплантационного материала от ДМСО. Вывод. Отмывание трансплантационного материала от ДМСО приводит к снижению количества ГСК и их способности к кроветворению.