Genetic modification of human adipose derived stem cells with pEGFP-N2 plasmid DNA does not affect cytokines/chemokines secretion

Abstract

Full Text

Ввведение. Одним из перспективных источников стволовых клеток является жировая ткань. Стволовые клетки из жировой ткани (adipose derived stem cells, ADSC) секретируют множество трофических и протекторных факторов, что является одной из причин, обуславливающих их терапевтическую эффективность при трансплантации. В то же время, для повышения эффективности клеточной терапии рассматривается возможность генетической модификации стволовых клеток вирусными и невирусными векторами. Однако влияние генетической модификации на секрецию цитокинов стволовыми клетками из жировой ткани недостаточно исследовано. Цель исследования. Провести анализ секреции цитокинов/хемокинов стволовыми клетками из жировой ткани человека, генетически модифицированными плазмидой pEGFP-N2. Материал и методы. Образцы подкожной жировой клетчатки были получены в ходе плановой косметологической операции (липосакции). Стволовые клетки из жировой ткани были выделены с помощью ферментативной обработки, как описано ранее [Zuk et al., 2002]. Выделенные клетки культивировали с использованием среды aMEM, к которой было добавлено 10% сыворотки крови плодов коровы, 2 мM L-глутамина, 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (ПанЭко, Москва), при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2. Генетическую модификацию (трансфекцию) клеток ADSC плазмидным вектором pEGFP-N2 (BD Biosciences Clontech, Германия), экспрессирующим зелёный флуоресцентный белок GFP (англ. Green fluorescent protein), проводили трансфекционным агентом TurboFect (Thermo Scientific™) по методике, рекомендуемой производителем. Эффективность трансфекции определяли по количеству EGFP позитивных клеток методом флуоресцентной микроскопии на инвертированном флуоресцентном микроскопе AxioOberver.Z1 (Carl Zeiss, Германия). Культуральную среду от клеток, трансфицированных плазмидами, собирали через 24 ч после трансфекции, очищали от остаточного клеточного материала центрифугированием и фильтрованием через 0,45 мкм нейлоновый фильтр. Для мультиплексного анализа каждый исследуемый образец разводили в 10 раз. Уровень продукции цитокинов/хемокинов INF-y (cat#MXHIFNG, Bead 20), IL-1p (cat#HSIL-1B, Bead 24), IL-2 (cat#MXHIL-2, Bead 28), IL-8 (cat#MXHIL-8, Bead 40), IL-10 (cat#MXHIL-10, Bead 44), IL-12 (cat#MXH12P70, Bead 48), MCP-1 (cat#MXHMCP-1, Bead 58) оценивали методом проточной флуориметрии на мультиплексном анализаторе Luminex®200™ с использованием микросфер MILLIPLEX® MAP в соответствии с инструкцией фирмы производителя (Millipore). Концентрации аналитов были рассчитаны с использованием стандартной кривой, с помощью программного обеспечения Luminex IS 2.3. Результаты. Проведен сравнительный анализ нативных и генетически модифицированных стволовых клеток из жировой ткани человека по уровню продукции TM-противовоспалительных цитокинов INF-y, IL-1P, IL-2, IL-12, Th2-противовоспалительного цитокина IL-10, хемокинов IL-8, MCP-1. Концентрация INF-y в культуральной среде нативных клеток составила 5 пг/мл, IL-1 р - 4 пг/мл, IL-2 - 3 пг/мл, IL-8 - 1588 пг/мл, IL-10 - 12 пг/мл, IL-12 - 8 пг/мл и MCP-1 - 4954,5. Концентрация INF-y в культуральной среде генетически модифицированных клеток составила 2 пг/мл, IL-1 р - 5 пг/мл, IL-2 - 4 пг/мл, IL-8 - 2268 пг/мл, IL-10 - 15 пг/мл, IL-12 - 8 пг/мл и MCP-1 - 3702 пг/мл. Выводы. Генетическая модификация клеток ASCs с помощью плазмидного вектора pEGFP-N2 не привела к изменению продукции цитокинов/хемоки-нов по сравнению с нативными клетками. Это свидетельствует об отсутствии нежелательных побочных эффектов генетической модификации, связанных с процедурой трансфекции и переносом векторной рекомбинантной плазмидной ДНК в клетки-мишени.