Use of the chemiluminescent analysis in made dendritic vaccine

Abstract

Full Text

Противоопухолевая вакцина на основе дендритных клеток (дендритная вакцина) является относительно новым способом лечения больных с онкологическими заболеваниями. Дендритная вакцина состоит из двух основных компонентов: собственно дендритных клеток (получают из крови пациента) и опухолевых белков, источником которых является опухолевая ткань больного. Эффективность дендритной вакцины при онкологических заболеваниях и сложность получения дендритных клеток диктуют необходимость разработки методов оценки степени «созревания» дендритных клеток. Маркером стадии развития дендритных клеток может явиться снижение их фагоцитарной активности. Фагоцитоз сопровождается реакцией «респираторного взрыва» с участием НАДФН-оксидазы и образованием активных форм кислорода. Интенсивность синтеза активных форм кислорода в фагоцитирующих клетках можно определить с помощью хемилюминесцентного анализа. Целью исследования явилась оценка степени незрелости дендритных клеток при получении дендритной вакцины с помощью хемилюминесцентного анализа. Материал и методы. На базе НИИ медицинских проблем севера СО РАМН и Красноярского краевого клинического онкологического диспансера им. А.И. Крыжановского проведено исследование хемилюминесцентной активности дендритных клеток 45 больных раком почки в возрасте от 38 до 62 лет. В качестве контрольной группы были обследованы 33 здоровых донора аналогичного возрастного диапазона. Исследования проводились в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации (WMA, 1964). Из периферической крови практически здоровых людей и больных раком почки стандартным методом выделяли моноциты с последующей инкубацией в RPMI 1640 с добавлением 10% аутосыворотки. Дифференцировка моноцитов в дендритные клетки осуществлялась с помощью гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (100 нг/мл) и а-интерферона (1000 ед./мл). Культирование осуществляли 5 дней, затем добавляли фактор некроза опухоли-а (TNFa) с последующей инкубацией в течение 3 дней. Стадии созревания дендритных клеток определяли методом проточной цитометрии. Маркером дифференцировки моноцитов в дендритные клетки являлась экспрессия С083 + С014-С080 + С086 + -антигенов. Хемилюми несцентную активность дендритных клеток определяли в периоды 5 и 8 дней после начала инкубации. Реакционная смесь для хемилюминесцентной реакции состояла из 20 мкл сливной донорской сыворотки AB(IV)Rh(-), 50 мкл люминола или люцигенина (Sigma, США) в концентрации 10-5 М, 40 мкл оп-сонизированного зимозана (в случае определения индуцированной хемилюминесценции), 200 мкл взвеси клеток (1 млн./мл) и 240 мкл раствора Хенк-са (ПанЭко, Россия) для определения спонтанной хемилюминесценции или 200 мкл раствора Хенкса - для индуцированной. Исследование люминол- и люцигенин-зависимой хемилюминесценции проводили в течение 90 минут на хемилюминесцентном анализаторе CL3606M (СКТБ “Наука”, Красноярск). Результаты хемилюминесцентного анализа характеризовали по следующим параметрам: время выхода на максимум интенсивности хемилюминесценции, значение максимума интенсивности хемилюминесценции, площадь под кривой хемилюминесценции. Для всех полученных данных определяли медиану (Ме) и интерквартальный разброс (С25-С75). Проверку гипотезы о статистической достоверности величин исследуемых показателей в независимых выборках проводили с помощью критерия Mann-Whitney. Достоверность изменения величин исследуемых показателей в зависимости от стадии созревания дендритных клеток оценивали по критерию Wilcoxon. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных программ Stаtistiса 8.0 (StаtSоft 1пс., USA). Результаты и обсуждение. При сравнительной оценке хемилюминесцентной активности незрелых дендритных клеток больных раком почки выявлено снижение интенсивности хемилюминесценции и площади под хемилюминесцентной кривой как спонтанной, так и индуцированной хемилюминесцентной реакции относительно контрольной группы. При сравнительной оценке хемилюминесцентной активности дендритных клеток до и после трехдневной инкубации с TNFa выявлено значимое снижение интенсивности спонтанной хемилюминесценции, интенсивности зимозан-индуцированной хемилюминесценции, площади под хемилюминесцентной кривой и индекса активации зрелых дендритных клеток относительно незрелых как в контрольной группе, так и в группе больных раком почки. Таким образом, установлено, что в процессе созревания дендритные клетки утрачивают хемилюминесцентную активность, а следовательно, и способность к фагоцитозу. Метод хемилюминесценции может быть применен для определения стадии созревания дендритных клеток. Грант на исследование предоставлен Красноярским краевым фондом поддержки научной и научнотехнической деятельности.